H2AX的检测方法简介

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DNA 损伤有许多不同的形式, 如碱基修饰, DNA 单链断裂(DNA single stranded breaks, SSBs) , DNA 链内 和链间交联以及 DNA 双链断裂( DNA double stranded breaks, DSBs) 等, 其中 DSBs 被认为是 DNA 最严重的损 伤。细胞在 DSBs 发生后, 产生一系列的应激反应, 其 中一个主要的反应就是毛细血管共济失调突变基因 ( ataxia telangiectasia mutated, ATM) 起始的信号级联反 应, 它使细胞周期停顿直到损伤修复。H2AX 是这一 信号级联反应中的一个主要成员, 它能被 ATM 磷酸化 ( 称为 ? H2AX, 或 gammaH2AX) , 并在随后的损伤修复 过程中发挥着重要的作用 1 -2 。 H2AX是组蛋白H2A 家族成员之一。在H2AX 的 C -端有一段由 22 个残基组成的高度保守的同源序列, 其中包括一个 139位的丝氨酸残基, 在细胞发生 DSBs 后能被特异的磷酸化 3 。H2AX 除了能被 ATM 磷酸 化, 另外 2 个磷脂酰肌醇 3 -激酶( phosphatidylinositol 3 - kinase, PI3K) 家族成员 ATM 与 Rad3 相关蛋白 ( ATM and Rad3 -related protein,ATR) 和 DNA 依赖性蛋白激酶 (DNA -dependent protein kinase, DNA -PK) 也能催化这一 反应 1, 4 。磷酸化的 H2AX 在 DSBs 位点形成焦点 (focus) , 并进一步募集一些损伤修复相关蛋白, 如 BRCA1 ( breast cancer associated gene 1) 、 53BP1 ( p53 binding protein 1) 、 Rad50 和 NBS1 等, 对 DSBs 进行修 复 5 -6 。H2AX 缺失小鼠表现出辐射敏感性、 生长迟缓、 免疫缺陷和雄性突变小鼠不育等病变特征 7 -9 。另外, 虽然H2AX 缺失小鼠并不表现出肿瘤发生率的提高, 但是H2AX 和 p53都缺失的小鼠比 p53 单独缺失的小 鼠的肿瘤潜伏期和生存周期更短 8 。因此, ? H2AX 在 细胞 DNA 损伤应激反应以及癌症诱发过程中可能发 挥着极为重要的作用。 此外, 由于 ? H2AX 的出现与 DSBs 紧密相关, 且存 在着一一对应关系 10 , ? H2AX 也被认为是检测细胞 DNA 双链断裂的一个新的特异性指标, 并因此引起了 国内外研究者们的广泛关注。最近我们实验室的研究 结果证实, ? H2AX与公认的反映 DNA 双链断裂的彗星 试验具有很好的相关性。比如, 使用 ? H2AX 和中性彗 星试验都可揭示烷化剂甲基硝基亚硝基胍( N -methy- l N? -nitro -N -nitrosoguanidine,MNNG) 可诱导 DSBs 的形成, 并且存在明显的时间效应; 而且与彗星试验相比, ? H2AX焦点出现的时间较彗尾出现的时间更早 11 。 应用另外一批化学( 物理) 刺激因素的研究也得到 了相似的结果, 说明 ? H2AX 可以作为 DNA 损伤检测 的一个比较灵敏的指标 12 。我们就目前国内外对 ?408?毒理学杂志2006 年12 月第20 卷第6 期? J Toxicol December 2006 Vol?20? No?6 ? H2AX的检测方法作一简要介绍, 这些方法主要包括 免疫荧光、 流式细胞术和免疫印迹。 1? 免疫荧光(Immunofluorescence, IF) 免疫荧光法是目前研究 ? H2AX 的最主要的方法。 免疫荧光的基本原理和实验流程是: ( 1) 1? 10 5 细胞接 种到每孔内已放有盖玻片的6 孔板中; ( 2) 细胞培养 24 h 后用药物处理; ( 3) 处理结束后, 细胞在质量浓度为 4% 的多聚甲醛中 4 ? 固定 15 min; ( 4) 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤, 体积分数为 0?2% 的 Triton -X 100 破膜 15 min; ( 5) PBS 洗涤, 羊血清工作液封闭 1?5 h; ( 6) PBS 洗 涤, 抗 ? H2AX 一抗( 1?1 000) 孵育 2 h; ( 7) PBS 洗涤, 标 记二抗( 1?500) 作用 1 h; ( 8) PBS 洗涤, 体积分数为 90% 的甘油封片, 荧光 显微镜观察。如果 细胞中 H2AX被磷酸化并形成焦点, 在荧光显微镜下可见到 绿色的小点, 这些小点就是 ? H2AX 焦点。另外, 应用 免疫荧光方法能够进一步检测 ? H2AX 与其他损伤修 复相关因子的相互作用情况。例如, Paull 等 5 应用免 疫荧光技术发现, ? H2AX 与 BRCA1、 Rad50 和 Rad51 协 同定位于 DSBs 发生位点, 证明了H2AX 磷酸化后能进 一步募集一些损伤修复相关因子来发挥修复作用。具 体的方法是将 ? H2AX 标记上FITC, 然后将另外一种蛋 白标记上另外一种荧光素, 如镜下呈红光的 Cy3, 然后 在镜下观察时分别采用不同激发光对不同的标记荧光 素拍照, 绿色表示 ? H2AX, 红色表示另外一种目的蛋 白, 最后将这 2 张照片利用软件重合。如果 2 个点能 重合的话, 就呈现出黄光, 显示这 2种蛋白共定位。 2? 流式细胞技术(flow cytometry,FCM) 流式细胞技术是检测细胞中特异蛋白或细胞内 DNA 含量的有力工具。目前, FCM 在生物学、 基础医 学和临床医学中都得到了广泛的应用, 它可以用于细 胞凋亡、 细胞周期的分析和细胞免疫表型的分型等。 研究者们也利用 FCM 来检测细胞中 ? H2AX 含量的变 化。例如, Olive 等 13 应用 FCM 发现在经过 Etoposide 或Tirapazamine 处理后, 细胞中的 ? H2AX 含量均发生 了显著的增加。该法实验步骤如下: ( 1) 细胞进行处理 后,TPBS 洗涤, 胰酶消化, 离心1 500 r? min, 10 min, 收 集细胞; ( 2) 用预冷体积分数为 70%的乙醇 4 ? 固定 1 24 h, 离心收集细胞; ( 3) TPBS 洗涤, 离心收集细胞; ( 4) 加入体积分数为 10%的 FCS( 胎牛血清) , 4 ? 封闭 30 min; ( 5) 离心收集细胞, 加入抗 ? H2AX 一抗( 1? 1 000) ,室温孵育 2 h; ( 6) TPBS 洗涤, 离心收集细胞, FITC 标记二抗( 1?500) 孵育 1 h; ( 7) TPBS 洗涤, 制成细 胞悬液, 机检。另外, 应用 FCM 通过双染技术, 能进一 步揭示 ? H2AX含量的变化与细胞周期的相关性。例 如,Takahashi 等 14 FCM 发现, H1299 细胞在经过热休 克后, ? H2AX 的含量有了明显的升高, 并依赖于细胞 周期: 当处于S 期的细胞经过热休克处理后, 比经过热 休克处理的 G1和 G2-M 期的细胞中 ? H2AX 含量升高 得更快。 3? 免疫印迹(Western Blot) 免疫印迹法是一种蛋白质的固定和分析技术。将 已用聚丙烯酰胺凝胶或其他凝胶电泳分离的蛋白质转 移到硝酸纤维素膜上。固定在滤膜上的蛋白质成分保 留抗原活性及与其他生物大分子特异性结合的能力, 所以能与特异的抗体或核酸结合来进一步检测。Ward 和 Chen 4 应 用 Western Blot 发 现, HBL100 细胞 中 ? HA2X的含量在分别经过羟基脲、 UV 或离子辐射处 理后, 均有明显地增高。该法实验操作步骤如下: ( 1) 制备蛋白质样品, 用质量浓度为 15% 的 SDS -PAGE 分 离蛋白; ( 2) 转膜: 将蛋白电转移至硝酸纤维素膜( NC 膜) 上, 转膜条件为 4 ? 80 V 转 1 h; ( 3) 终止转膜, 取 出NC 膜后, 随即用 1? 丽春红 S 溶液染色 10 min, 用 红色圆珠笔标明蛋白 Marker 条带的位置; ( 4) 封闭: 用 封闭缓冲液封闭 NC 膜 1 h; ( 5) 一抗孵育, 用含抗 ? H2AX一抗的封闭液( 按 1?1 000稀释) 孵育 2 h 后撤 除, 用TBS -0?05% Tween -20( 体积分数) 洗膜 3 次; ( 6) 再换成含二抗的封闭液( 按 1?2 500稀释) 孵育 1 h 后 撤除, 用 TBS -0?05% Tween -20 洗膜 3 次; ( 7) 显影, 进 暗室, 用适量增强化学荧光( ECL) 液浸泡NC 膜 1 min, X 线片压片后进行显影与定影。出现在 15? 10 3 位置 的条带便是? H2AX蛋白条带。 4? 各种方法的优缺点及注意点 应用免疫荧光方法检测 ? H2AX 的方法的最大的 优点就是直观、 形象。我们可以通过成像系统直观地 得到单细胞中 ? H2AX 焦点的形成情况, 另外能够观察 到? H2AX与其他蛋白的作用情况。但是应用免疫荧 光技术检测 ? H2AX的过程中, 也存在着问题。在不同 的研究中, 这种镜下观察得到的 ? H2AX 焦点的大小和 荧光强 度在不同的条件下可能发生变化。例如, Reitsema 等 15 发现在 IR 处理后, 细胞再在 0?5 mol? L Na + 中孵育后, ? H2AX 焦点的大小增加了 4 倍, 然而焦 点的数目并未发生变化; 另外焦点的荧光强度在 Na + ?409?毒理学杂志2006 年12 月第20 卷第6 期? J Toxicol December 2006 Vol?20? No?6 孵育后也出现了增加 15 。此外, 本研究室在应用免疫 荧光技术检测 ? H2AX 焦点的过程中, 发现了一种特异 的全核染色方式。在这类细胞中, ? H2AX 焦点并不是 形成绿色小点, 而是整个细胞核都被染成了绿色 11 。 因此, 在分析免疫荧光结果时, 不仅要分析焦点的多 少, 同时也要充分考虑到焦点的大小及强度所代表 DNA 损伤的程度。 FCM 的结果比较客观、 准确, 统计学精度也比较 高, 此外能进一步结合细胞周期来分析? H2AX 含量的 变化。但是, FCM 并不能从单细胞角度分析 ? H2AX 焦 点的形成情况, 因此也无法确定单细胞中DSBs形成的 情况。 免疫印迹是一种定性分析蛋白质含量变化的方 法。因此, 它只能检测到 ? H2AX 含量的变化, 其他功 能方面都不如免疫荧光技术或 FCM。但是免疫印迹 所需要的设备要求低, 极易开展工作。 5? 结束语 综上, 上述这 3 种方法各有其优缺点。在具体的 科研工作中, 需要按照实际的实验目的要求, 选择适当 的实验方法来检测 ? H2AX。 参考文献: 1 ? Wang H,Wang M,Bocker W,et al.Complex H2AX phosphorylation patterns by multiple kinases including ATM and DNA -PK in human cells exposed to ionizing radiation and treatedwith kinase inhibitors. J Cell Physiol, 2005, 202: 492 - 502. 2 ? 余艳柯, 路源, 余应年, 等. ? H2AX: DNA 双链损伤的标 志. 中国药理学与毒理学杂志, 2005, 19: 237 -240. 3 ? 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