原生质体培养实验.ppt

实验五原生质体培养,一、实验目的与意义学习原生质体制备和培养的方法。原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗，最终再生成完整植株。,二、实验器材超净工作台、震荡摇床、各种接种工具、微孔滤膜过滤器三、实验药品MS培养基各种母液、NAA、6-BA、2，4-D、2-N-吗啉乙磺酸（MES）、纤维素酶（OnozukaR-10，Japan）、崩溃酶（Driselase）、果胶酶（Pectinase、Serva）、半纤维素酶（Hemicellulase，Sigma）、离析酶（MacerozymeR-10）、CaCl2.2H2O、KH2PO4.H2O、KN03、MgS04.7H20KI、CUS04.5H2O、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、琼脂。,四、实验步骤1、培养基及试剂的配制原生质体培养基：MS+2，4-D0.5+NAA1+BA0.5+蔗糖250mg/L+葡萄糖10000mg/L+（琼脂1.2%）CPW溶液：KH2P0427.2mg/L，KN03101mg/L，CaCl2.2H201480mg/L，MgS04.7H20240mg/L，KI0.16mg/L，CuS04.5H200.025mg/L，pH5.6)。质壁分离液CPW-13M的配制：含有13%甘露醇的CPW溶液细胞壁酶解液：2%(W/V)纤维素酶(cellulaseOnzukaR-10)、1%(W/V)半纤维素酶(hemicellulaseH-2125,0.026unit/mg)、0.5%(W/V)果胶酶(pectinase,0.15unit/mg)、0.5%离析酶（MacerozymeR-10）的CPW-9M(含有9%甘露醇，5mmol/LMES的CPW溶液，pH5.2)液。洗涤液：含或不含250mol/LCaCl2，含5mmol/LMES的9%甘露醇溶液，pH6.0。,2、酶解选取烟草愈伤组织1g置于小培养皿中加入1.5-3.0ml酶混合液，轻摇匀封口，在往复式摇床(35-40r/min,25士1)上暗中酶解6-8h。（材料和酶解液的体积大约1：10）,灭菌:过滤,3、纯化用双层尼龙滤网(孔径64um)过滤酶解液，滤液800rpm离心10min，弃去上清液。用少量CPW-9M溶解沉淀，小心加入盛有CPW-21S(含有21%蔗糖的CPW溶液，pH5-6)溶液的离心管中，800rpm离心5min，溶液分为3层，仔细将漂浮在溶液中部的原生质体取出，经洗涤液洗涤2次，离心，获得纯净的、具有生理活性的原生质体。4、密度测定与调整将原生质体溶解在培养液中，用血细胞计数板记数。,5、培养用融化的培养基将原生质体密度调整为5105/mL，将其植板于培养皿中，使成一薄层，凝固后，切成4个扇形块，加入液体培养基，使扇形块漂浮其中，置于27士1黑暗培养，培养7、14、21d，除去旧液，加入新培养基（蔗糖含量为20mg/L，葡萄糖10g/L，其他成分与MS相同。培养一周后能见到几个细胞以上的细胞团。继续培养细胞团形成愈伤组织。五、思考题原生质体制备与培养过程中要注意哪些问题？常用的原生质体培养方法有哪些？,烟草原生质体高效快捷培养技术：A、原生质体游离纯化：取培养30天的烟草无菌叶片，放入酶解液中，酶解液经0.22m混合纤维素微孔滤膜过滤除菌，其pH5.8，酶解结束，酶解液以900rpm离心7-8min，去掉上清，向所得沉淀中缓缓加入6ml的CPW21盐溶液并使沉淀悬浮，以800rpm离心6-7min，用巴斯德吸管小心地将处于离心管上部的原生质体带吸出，并以CPW10溶液洗涤2-3次后得到的原生质体便是纯净的原生质体；,B、原生质体培养：将纯化的原生质体以0.5mlMS1培养基轻轻悬浮，与等体积的MS2培养基混合均匀，加入30mm10mm培养皿，用Parafilm膜封口后放入27恒温培养箱中倒置(防止水分蒸发)进行暗培养；其中将MS基本培养基中的大量元素减半，得到1/2MS，加入了2.4-二氯苯氧乙酸2.5mg/L、6-糠基嘌呤0.5mg/L，另外含有蔗糖30g/L和甘露醇80g/L；MS2为1/2MS，加入6-苄基嘌呤0.5mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、奈乙酸0.5mg/L，另外含有蔗糖30g/L和甘露醇80g/L，培养10天后，获得微小愈伤组织，直接将微小愈伤组织转入芽分化培养基，该培养基为MS，加入了噻重氮苯基脲0.5