基因工程第二章DNA重组技术.ppt

第二章DNA重组技术,主要内容,DNA的结构天然DNA的制备限制性核酸内切酶对DNA的切割.PCR扩增特定DNA片段凝胶电泳检测DNADNA片段的连接重组,第一节DNA的结构,一、DNA组成Nucleicacidispolynucleotide,NucleotidesarethebuildingblocksofNucleicAcidDNA.,首,尾,Pentosefive-carbonsugar,2-Deoxyribose2脱氧核糖,1、核苷酸,Phosphate、pentose、base(碱基),Hydrogen氢,Thymine胸腺嘧啶T,Cytosine胞嘧啶C,Guanine鸟嘌呤G,Adenine腺嘌呤A,FourBasesinDNA,Pyrimidines嘧啶,Purines嘌呤,H2O,碱基,五碳糖,核苷键,核苷,602,H2O,H2O,base,Phosphate,Pentose,核苷键,Phosphateesterbond,核苷酸Nucleotide,Glycosidicbond,8种核苷酸,M-单(D-二。T三）；P-磷酸RNA的名称为某（单、二、三）苷酸，DNA在某（单、二、三）前加脱氧两字。如AMP称腺苷磷酸(或腺苷酸），dAMP称为脱氧腺苷磷酸（脱氧腺苷酸）。稀有核苷酸与上类似；,2、DNA,DNA中核苷酸通过3,5-磷酸二脂键连接,二、DNAstructure,1、B型DNA双螺旋,MostDNAhavedoublehelixstructure,(1).两条链反向、平行、右手螺旋,有大沟和小沟,(2).磷酸、戊糖在外侧，碱基在内，链间碱基形成氢键。,（3）.两碱基对间距0.34nm,螺距3.4nm.,经常用碱基对数来表示DNA长度,(4).碱基互补配对原则：A=TC=G,2、DNA序列,在DNA中，两链间的碱基是互补的知道其中一条链的序列后，另一链也可推测出来。因此DNA序列一般只用其中一链序列由5向3书写,5TCTC33AGAG5,5TCTC3,3、DNA变性,DNA变性：DNA双链打开变异无规则的单链的过程。粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加.变性因素：加热,改变溶液pH、加有机试剂,。,计算公式：（G+C)%=(Tm-63.0)2.44,解链温度（Tm）使50%DNA变性的温度.经常在70-85C间，随G/C含量的升高而升高.,4、DNA复性,变性因素去除后，变性DNA又恢复成双螺旋结构的过程。温度下降过快，DNA不能复性。,变性,复性,5分子杂交,具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链过程叫核酸分子杂交,只要有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。,DNA与DNA间的杂交,全部互补时,部分互补时,变性,复性,DNA与RNA间的杂交,全部互补时,部分互补时,变性,复性,6DNA的形状,线性DNA：真核生物的染色体部分原核生物染色体部分病毒,环状真核生物线粒体叶绿体部分原核生物染色体质粒部分病毒,ThecircularDNAcanbesupercoiled环状DNA以超螺旋形式存在,环状DNA,。,负超螺旋：形成超螺旋时，旋转方向与DNA双螺旋方向相反，旋转结果使DNA分子内部张力减小，称为松旋效应。在自然条件下共价封闭环状DNA呈负超螺旋结构。正超螺旋：与负超螺旋相反，形成超螺旋时的旋转方向与DNA双螺旋方向相同，结果加大了DNA分子内部张力，有紧旋效应。,7DNA的复制,半保留复制（原核、真核）Semiconservationreplication,亲代DNA分子,第一子代分子,亲代DNA分子,第一子代分子,DNA复制过程复制起始位点双链打开引物酶合成RNA引物，DNA聚合酶延长引物.前导链连续延伸,滞后链通过冈奇片段以不连续方式延伸。在新合成的DNA链中将RNA引物剪去，以DNA替代通过DNA连接酶将切口封闭。,复制泡:细菌、病毒、线粒体：单复制子真核：多个复制子，双向等速复制,8DNA的转录,转录的过程：起始（启动子），延长，终止转录后的加工：剪切，拼接及修饰.,(1)启动子：DNA上RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列,Inpromoterregions,thereisa10regionwhichsequenceis“TATAAT”andiscalled“pribnowbox”or“TATAbox”.Thereisa35regionwhichsequenceis“TTGACA”.Thesequencesofthetworegionsareveryconservative.,promoter基因编码区5-|-35|-|10|-A-AUG-UGA-|T|-3TTGACATATAATAGGAGG,Startsite+1,转录区,terminationsequence,-35region,-10region,SD序列,initiationcodon,stopcoden,(2)转录区,promoter基因编码区5-|-35|-|10|-A-AUG-UGA-|T|-3TTGACATATAATAGGAGG,Startsite+1,转录区,terminationsequence,-35region,-10region,SD序列,initiationcodon,stopcoden,转录起始位点（起录点）:转录在特定的位点开始,经常发生在A上.SD序列在起录点下游有：AGGAGG序列，对应的mRNA序列也是AGGAGG，可与核糖体中的rRNA序列TCCTCC互补结合，起始翻译。,基因编码区:从起始密码子到终止密码子间，含有遗传信息的的DNA序列。原核生物一个启动子和一个终止子间有多个基因编码区，每个基因编码区均有各自的起始密码子和终止密码子。真核生物只有一个基因编码区。,promoter基因编码区基因编码区5-|-35|-|10|-A-AUG-UGA-AUG-UGA-|T|-3TTGACATATAATAGGAGG,Startsite+1,Transcriptionregion,terminationsequence,-35region,-10region,SD序列,initiationcode,stopcode,间隔区,终止子：terminationsequenceDNA模板上的终止信号是由于DNA特殊的结构而起作用，此处DNA多存在着反向重复顺序。此区域容易形成发夹形结构，有助于转录的终止。,RNApolymerase中的亚基识别启动子区，并使RNA聚合酶结合.DNA在起始位点解旋成单链RNApolymerase开始转录.亚基脱离，RNA开始延长.RNA延长并从DNA中脱离在终止子处终止.,（3）转录的过程,转录后的RNA加工,真核生物RNA转录的初级产物需经过”加帽“”加尾”“剪切”“拼接”等一系列变化才能生成具有生物活性的RNA分子。这一过程称为转录后的RNA加工(RNAprocessing)。,8翻译,以mRNA为模板，按照mRNA分子上的三个核苷酸决定一种氨基酸的规则（三联体密码）合成具有特定氨基酸顺序的蛋白质称为翻译。,一、天然DNA的来源与用途来源：从不同生物的不同部位分离染色体DNA(ChromosomeDNA)病毒DNA(VirusDNA)质粒DNA(PlasmidDNA)线粒体DNA(MitochondriaDNA)叶绿体DNA(ChloroplastDNA),第二节天然DNA的提取,染色体DNA,特征:巨大,含有大量遗传信息(geneticinformation).用途:分离目的基因和基因表达调控因子,VirusDNA,可在宿主细胞内复制,可体外包装.可用作转基因载体或分离目的基因.,环状，游离与细胞质中，可自我复制。1几百kb主要用作基因克隆载体，也可分离目的基因。,质粒DNAPlasmidDNA,真核生物(eukaryote)有,基因与呼吸作用和光合作用相关.用途:分离目的基因或作载体.,线粒体DNA和叶绿体DNA,真核生物(eukaryote)有,基因与呼吸作用和光合作用相关.用途:分离目的基因或作载体.,线粒体DNA和叶绿体DNA,二、天然DNA的提取,1、准备生物材料,1、准备生物材料,选用DNA最易提取，含量最多的组织。大肠杆菌培养至对数生长后期。植物选用幼嫩植株，暗培养1-2天或黄化苗。,方法:细菌(Bacteria)：用溶菌酶(lysozyme)处理,NaOH和SDS处理超声波(ultrasonic)处理动植物:粉碎、捣碎、研磨,2、裂解细胞-KeystepofDNAextraction,提取总DNA(ExtractionoftotalDNA)：裂解液中加酚/氯仿/异戊醇等有机溶剂，分除蛋白质，在含DNA水相加入乙醇或异丙醇使其沉淀，离心获得DNA。提取线粒体DNA或叶绿体DNA：先分离完成细胞器，加DNase去除其他DNA，再提。提质粒DNA：先调pH值至12.6，再调至中性，使质粒复性后从沉淀中释放出来。,3、分离与抽提,提取总DNA(ExtractionoftotalDNA)：裂解液中加酚/氯仿/异戊醇等有机溶剂，分除蛋白质，在含DNA水相加入乙醇或异丙醇使其沉淀，离心获得DNA。提取线粒体DNA或叶绿体DNA：先分离完成细胞器，加DNase去除其他DNA，再提。提质粒DNA：先调pH值至12.6，再调至中性，使质粒复性后从沉淀中释放出来。,3、分离与抽提,大肠杆菌质粒DNA的提取ExtractionofplasmidDNAfromE.coli.,大肠杆菌质粒DNA的提取ExtractionofplasmidDNAfromE.coli.,1、细菌的培养培养基（Culturemedium）:LB,含有抗生素（bacteriophage）培养至对生长后期。离心收集菌体。不宜用高速长时间。,solution:葡萄糖,59mmol/L;Tris-HClpH8.025mmol/L,EDTApH8.010mmol/Lsolution:NaOH0.2mol/L;SDS1%solution:5mol/L醋酸钾60mL;冰醋酸11.5mL;ddH2O28.5mL,2、细胞裂解离心沉淀的菌体加入100uL溶液I，振荡，冰上5min，加入200uL溶液II，混匀。3、DNA的抽提冰上5min，加入150uL溶液III,振荡10s，冰上5min，离心后取上清液，加入2倍体积的乙醇沉淀DNA，再离心取沉淀.,植物DNA的提取,氯化铯法、CTAB法。具体步骤可参考分子生物学实验指南类工具书。,本试剂盒采用经典的SDS碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅胶膜在高盐低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅胶膜上洗脱。采用进口硅胶膜，吸附量大，产率高，实验结果可重复性好。与Zymo公司的产品相同，溶液中添加了进口作用指示剂，使每一步作用程度一目了然。不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速、方便，从15ml大肠杆菌LB（LuriaBertani）培养液中，可快速提取15-40ug纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达8590%。获得的质粒产量高，超螺旋比例高、纯度好。直接可以用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。,质粒DNA小量提取试剂盒,（离心柱型）,利用纳米技术合成的磁性纳米复合材料（磁珠），结合磁性分离技术和DNA提取技术，一步实现DNA的提取和纯化，从而获得高质量的DNA。本试剂盒无需特殊的设备，而且完全避免了与一些有毒试剂的接触（如酚、氯仿等），纯化的DNA可以广泛应用于如PCR，测序和杂交等下游分子生物学实验。除了样本处理过程，均无需离心，适合于自动化仪器使用。DNA提取的具体过程为：消化后的组织溶液和收集的细胞在裂解液的作用下，DNA特异性的结合在磁珠上，结合了DNA的磁珠在外加磁场的作用下从溶液中分离，再通过2-3次的洗涤过程将蛋白质等残留的杂质去除，最后在洗脱液的作用下DNA从磁珠上被洗下来，从而获得基因组DNA。,磁性组织基因组DNA提取试剂盒,基因组DNA提取系列(血液DNA提取试剂盒),产品简介H.Q.&.Q.血液DNA提取试剂盒为您提供了一个快捷而简单的从100ul-1ml新鲜、冷冻和抗凝全血中分离基因组DNA的方法，这一方法同样适用于从鼠尾小段、血液、石蜡包埋组织、血清、血浆中提取基因组DNA。这一试剂盒可以在40min之内同时处理单个或多个的样品。通常一次单独的实验可处理最多1ml的全血。这一过程无须用到苯酚/氯仿抽提，而且那些较耗时的步骤，像：氯化铯梯度离心、异丙醇或乙醇沉淀等，都被摒除了。用H.Q.&.Q.血液DNA提取方法提纯得到的DNA可直接用于各种下游应用，如PCR、Southern杂交及限制性酶切等。应用JYZ-1-1/JYZ-1-2系列均提供OB蛋白酶，该试剂盒能从全血、纯的白细胞或培养的动物细胞中分离出DNA。若从干燥的血样中分离DNA可使用H.Q.&.Q.组织DNA提取试剂盒。结合能力每个Mu-Pu基因组DNA分离柱可结合大约30gDNA。我们建议不要一次使用大于1ml全血或250l培养的动物细胞。,三、DNA的纯化,1、离子交换层析法:在低盐浓度下DNA可与树脂或羟基磷灰石的钙离子相互作用而结合，随后用浓度梯度的NaCl或磷酸盐洗脱回收DNA即可纯化之。,ForDNAbinding,theDNAsolutionisappliedtoIonExchangeratfixedpHandlowsalt,ForelutionofDNAfromIonExchanger,ahighsaltisappliedtocolumn,2、DNA中EB的去除EB（ethidiumbromide）：溴化乙锭，EB可影响DNA的切割,对人有中等毒性，可诱变成癌症.正丁醇抽提法：DNA样品溶液中加入用溶解DNA的缓冲溶液饱和的正丁醇，轻轻混合，分相后，弃上相正丁醇，反复重复至上相正丁醇无桔红色为止。,3、DNA的浓缩：乙醇沉淀法：DNA中加2倍体积的乙醇，使DNA沉淀，离心收即可。,第三节限制酶及其对DNA的切割,一、限制酶（Restrictionendonucleases）已开发上百种，公司有卖.功能:能识别特定的核酸序列而将核酸切断。,1、定义一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。主要存在于细菌中。用于防止外源DNA入侵,2、分类I型、II型、III型。基因工程中应用的是II型，可识别特殊序列进行有规律切割。,3、命名一般以提取这类酶的生物属名和种名的第1、2个字母及菌株的代号来命名。如：HaemophilusinfluenzaeRd菌中提取的第三个酶可命名为HindIII,二、作用机理,底物：DNA可识别一定的核苷酸序列使两条链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH基团和5-P基因的片段。,RE,EcoR,三.识别序列recognitionsequences,共同特点：具有旋转对称性，或二重互补对称性,对于一条长DNA链中的酶识别序列可利用电脑分析。,四、酶切,切割方式有两种其一，两条链上断开的位置是交错的对称地分布在识别序列中心位置两侧，产生粘性末端。其二，两条链断开的位置在识别序列的对称中心产生平末端。,粘性末端,同尾酶：来源各异，识别序列相似，切割后产生的粘性末端完全相同。,平末端,五、酶切反应系统,1、底物DNADNA的纯度：乙醇、EDTA、SDS、酚等DNA的分子构型：线形环状识别序列的侧面序列：如仅含GAATTC的不会被EcoRI切，该序列两侧延长1到几个核苷酸后才行。DNA甲基化：识别序列被甲基化，会影响酶切效率。,2、酶的用量酶的活性越高用量越少底物DNA适合，用量少。3、反应的缓冲溶液（buffer）buffer最适合酶的活性最强。4、反应温度37,六、REStar活性,某些酶在特定条件下，可在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。排除方法：降低反应系统中甘油含量、控制在pH中性和高盐浓度下进行反应。,DNA的片段化：DNA酶切成可用于连接重组的DNA片段的过程。1、单酶切最常用，只用一种酶进行切割。13uLddH2O2uLbuffer摇匀，离心，室温1-3h，65104uLDNA分钟1uL酶,七、DNA的片段化,2、双酶切两种酶切割同一种DNA分子。产生两个不同的末端。先后分别切割：原则是先低后高。同时切割：反应条件相近，有共同的buffer。,3、部分酶切对DNA分子的全部识别序列进行不完全的切割。原因:DNA纯度低、甲基化、酶量不足、温度不适、时间不够等。,八、DNA的限制性图谱,DNA分子上每种限制性内切酶的识别序列分布图，称限制性图谱（restrictionmap）或称物理图谱(physicalmap)。,第四节特异性DNA片段的PCR扩增,一、概述在短时间内扩增特定DNA片段该片段可能是大量DNA混合物中的一段:e.g.aspecificexonofahumangene.,模拟细胞内的DNA复制过程，在数小时内可获得大量拷贝的DNA片段，步骤简便，结果可靠。,PCR功能强大,PCR可在2小时内获得足够多的DNA片段。模板不需很纯、如煮沸的细菌。PCR获得的DNA可切割、连接、测序。PCR可扩增单DNA模板,e.g.fromasinglecell。,PCR的发明,PCR（PolymeraseChainReaction）技术是1983年由美国CETUS公司的KarryMullis博士发明的，它是分子生物学在技术上的一次革命.,60-70年代有科学家Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。核酸体外扩增最早设想遗忘:很难人工合成寡核苷酸引物；当时很难进行测序.,DidHeReallyInventPCR?,发明过程Mullis在偶然想出的聚合酶链反应一文中写到:这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的。发展过程：开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化.,二、PCR的原理,类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-退火-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,DNA加热变性成单链引物退火与DNA结合DNA聚合酶延伸引物上三步重复30次,基本方案,PCR反应体系的成分：模板DNA缓冲溶液（Tris,铵离子（和/或钾离子），镁离子，牛血清白蛋白）核苷酸dNTPs(dATP,dTTP,dGTP,dCTP的混合物)引物DNA聚合酶（常用Taq酶）,PCR反应系统成份,引物,A,B,核苷酸,TaqDNA聚合酶,Mg2+,Mg2+,Mg2+,Mg2+,Mg2+,Mg2+,缓冲溶液,目标DNA,5,3,3,5,变性,目标DNA,95oC,5,3,3,5,5,3,3,5,退火,55oC,5,5,A,B,引物,A,B,5,3,3,5,延伸,72oC,5,5,TaqDNA聚合酶,3,5,5,3,Thebasicprotocol-extension,72oC,5,5,5,3,3,5,3,3,第一个循环结束,第二个循环开始,5,5,5,3,3,5,3,3,95oC,5,5,3,3,5,3,变性,5,3,5,5,5,3,3,5,3,3,5,5,5,5,55oC,退火,5,5,5,3,3,5,3,3,5,5,5,5,72oC,extension,5,5,5,3,3,5,3,3,5,5,5,5,72oC,延伸,第二个循环结束,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,95oC,变性,第三个循环开始,5,5,3,5,5,3,3,5,5,5,5,55oC,退火,5,5,3,5,5,3,3,5,5,5,5,72oC,延伸,3,5,5,3,5,5,3,3,5,5,5,5,5,3,3,72oC,延伸,目标DNA,目标DNA,第三个循环结束,5,3,5,94oC,变性,第四个循环,3,40oC,退火,72oC,延伸,每循环一次，目的DNA片段增加一倍30次循环后可达109条,230=1,073,741,824,动画33,常规PCR：一对引物，扩增一条DNA片段。多重PCR（Multiplex-PCR）：多对引物，同时扩增多条DNA片段。,PCR操作过程：（1）引物（primer）的设计与合成：根据已知的基因序列，设计合成用于扩增特异性基因片段的寡聚核苷酸引物。（2）模板（template）DNA的提取。（3）PCR扩增：取一定量的DNA提取物，加入过量引物，TaqDNA聚合酶，dNTP，PCR反应缓冲液，Mg离子，PCR仪（ThermalCyclers）上扩增。（4）结果分析：采用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。,PCR仪热循环仪,该仪器可实现PCR程序中各步骤间温度的迅速升降可自动化控制，输入各步骤的温度、时间等参数后自动完成反应程序。,三、PCR反应成分及功能,（一）、DNA聚合酶的选择1.KlenowDNA聚合酶:缺点:受热失活；产物混合其他DNA分子；产物混合大量杂蛋白扩增DNA小于400bp.,2、TaqDNApolymerase1969年，美国黄石国家公园温泉中分已克隆了该酶基因，表达蛋白已成功纯化，其分子量为94kD、活性：在几种水栖热菌中活性最高，200000U/mg、离子需要：对Mg2+，单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。适当浓度的KCl可使合成率增加5060，,、忠实性有53聚合酶活性，无35外切酶活性。没有校正单核苷酸错配功能致命弱点。一般出错率为210-4核苷酸/循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。如何避免错配？使用有校对功能的酶。,抑制剂尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂。内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。保存:在-20至少6个月。,3PwoDNApolymerase有53聚合酶活性和35外切酶活性，有校正单核苷酸错配功能，准确度比Taq酶高10倍。可扩增DNA片段的长度5kb。产物为平末端DNA片段，可直接进行连接。,4TthDNA聚合酶有53聚合酶活性，无35外切酶活性，在有Mn离子时有反转录酶活力，有Mg离子时可进行PCR扩增。该酶可用于RT-PCR可扩增DNA片段的长度1kb,（二）、模板DNATemplateDNA,dsDNA，ssDNA,DNA的来源：根据研究对象不同DNA来源不同：动物可提取血液或特定组织中的DNA植物可取叶片，芽等组织。真菌、细菌直接提取菌体DNA对于RNA样品，首先需要反转录成cDNA才能进行PCR扩增，DNA远比RNA稳定。,（三）、引物（primes）,1、设计时应注意事项(最重要)(1)、长度:2027bp,(2)、G+C含量：40-60%，ATCG随机分布,Iftherearecomplementarysequencesbetweentwoprimers.,ThetwoprimersareComplementaryat3end,5,3,5,3,Primerdimer引物二聚体,ThetwoprimersareComplementaryat5end,5,3,5,3,Thetwoendsofoneprimerarecomplementary,Primercyclize,internalcomplementarity,(3)、引物内和引物间无互补序列,(4)、引物的3端：不能修饰(5)、引物的5端：决定产物长度，可以修饰，加上限制性酶切位点。,5enddeterminethelengthofthePCRproduct.,(6)、序列的特异性利用已知序列设计引物，扩增未知DNA片段时，已知序列在引物区的序列同源性应尽可能大，小于70%就可能出现非特异性扩增。,5,3,5,3,5,3,5,3,ATCGAATGTGGCAT,ATCGAATGTGGCAT,ATCGAATGTGGCAT,ATCGAATGTGGCAT,里氏木霉CBH2基因,绿色木霉CBH2基因,李氏木霉CBH2基因,康氏木霉CBH2基因,TGGAATCG,TCGAAACC,TAAAACCG,T?AA?C?,2、PCR扩增长度不同的DNA聚合酶不同,最长可达10Kb,一般在2kb以内。3、保存冻干引物于-20可保存1-2年，液体状态于-20可保存6个月。一般均在-20保存4、反应引物终浓度0.2-1mol/L。浓度过高易形成引物二聚体，浓度过低，降低PCR的产率.,引物的设计必须借助计算机进行序列利用网络中的数据库如：GenBank，网址：进行基因序列保守的比较利用相关软件：如上述网站中的blast工具,4、PCR反应体系的其他成分,（1）缓冲溶液10-50mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8,20）（2）Mg2+：为提高TaqDNA聚合酶的活性含量：低:低活性，高:非特异性扩增,（3）dNTPs（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）贮备dNTPs液：1mol/LNaOH调pH至中性。贮备浓度为10mmol/L，终浓度为20-200umol/L，分装-20保存。4种dNTP浓度应相同。,5、PCR循环的温度与时间,预变性9410min变性9430s退火40-6030s延伸70-752min延伸70-7510min,循环:25-30次,（六）、PCR的扩增平台期,平台期：PCR过程经过一定次数的循环后，待扩增的DNA片段不再以指数关系累积，而进入线性关系累积。进入平台期的原因：模板DNA过量引物或dNTP的量不足。DNA聚合酶中途失活。,四.PCR的优化,1、变性温度和时间变性不完全失败。一般94基因的G和C多，可提高变性温度.过高或时间过长，酶活性会损失。,2、退火(annealing)温度与时间通常37-55、30s2min。引物G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，可提高温度。温度越高，产物特异性越高。,温度应通过实验确定.每次实验温度递增(减)2.可使用梯并PCR仪.,3、延伸的温度与时间常用72.时间：对低浓度的、序列长的DNA片段，可延长时间。时间过长，非特异性增加。一般在扩增后，需一步较长时间的延伸反应。4循环次数:25-30个足够。循环过多，非特异性增加,5Mg2+浓度,Mg2+低，产物少.Mg2+高，非特异性高。,强大扩增能力，检测敏感极微量的污染便可导致假阳性。,五、PCR污染及其对策,1污染源、点样器和加样器、离心机、微解剖刀、浓缩用具、电泳装置等等。,2污染的预防(1)隔离不同操作区：前处理、后处理在不同隔离工作台或房间进行。(2)分装试剂：去离子水、缓冲液、吸头、离心管等均应高压灭菌。引物不能高压，用灭菌的去离子水在无菌条件下配制。试剂均应在无PCR扩增产物区制备、分装与贮存。,(3)改进实验操作:戴一次性手套操作。避免反应液的飞溅。用一次性移液器或吸头。(4)结果的重演:反复验证,六.PCR扩增产物的分析法,1凝胶电泳分析法琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定产物大小，还可以纯化扩增产物。2点杂交当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适3序列测定最准,4其他：微孔板夹心杂交法、PCR-ELISA法、颜色互补分析法、单一核苷酸引物延伸法PCR-OLA,第五节凝胶电泳分析DNA片段AnalysisofDNAfragmentbygelelectrophoresis,一、核酸电泳的原理：核酸是兼性离子，具有等电点(DNA44.5，RNA22.5)。在中性或碱性缓冲系统中带负电。,电泳：在外电场作用下，由于离子所带电荷大小和性质不同，其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。,兼性离子,带正电荷离子,带负电荷离子,2、电泳迁移率与DNA的构型和大小相关。,大小相同：超螺旋结构最快，环状结构次之，线性结构最慢。构型相同：越小越