免疫共沉淀原理及注意事项

共免疫沉淀(共免疫预处理，Co-IP)，单核细胞金，一种实验原理，一种基于(抗体和抗原)之间特异性相互作用研究(蛋白质相互作用)的经典方法。这是确定两种蛋白质在完整性(细胞内合理性)上相互作用的有效方法。如果X与蛋白X的抗体免疫沉淀，体内与X结合的蛋白Y也会沉淀。问题：细胞如何保持其生理状态不变性？异硫氰酸盐的应用不同于异硫氰酸盐。确定两种靶蛋白是否在体内结合以确定特定蛋白的新作用配偶体共激蛋白和共激蛋白仅取决于检测焦点是主要靶分子(抗原)还是次要靶分子(相互作用蛋白)。实验的基本原理。1.蛋白质2的提取。向细胞裂解物3中添加抗X抗体。孵育后加入蛋白质或G(在琼脂糖珠上)如果细胞中有靶蛋白与目的蛋白结合，可形成复合物：“Y-X-抗X抗体-蛋白质或G3”。变性和聚丙烯酰胺凝胶电泳后，复合物再次分离。(xy抗原，X抗体)，蛋白A/G有一个非常重要的特点，就是它能与抗体的Fc片段、琼脂糖珠、一氧化碳-IP原理图、蛋白A/G-琼脂糖珠复合物结合，蛋白A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白，它能与人和哺乳动物的Fc区抗体(主要是IgG)特异性结合。蛋白质/G目前广泛用于在argarosebeads上预结合。蛋白酶/G的作用和特定原理，“捕获”抗体形成复合物，抗体-靶蛋白-蛋白酶/gbeads非共价结合蛋白/G-琼脂糖珠共价结合加载缓冲液-沸腾变性-离心蛋白/Gbeads左EP管(抗体-靶蛋白-少量非特异性吸附蛋白)。(1)相互作用的蛋白质在翻译后都被修饰并处于自然状态，(2)蛋白质的相互作用在自然状态下进行，可以避免人类的影响，(3)在自然状态下相互作用的蛋白质复合物可以被分离，相互作用的蛋白质特征，局限性，(1)低亲和力和短暂的蛋白质-蛋白质相互作用不能被检测到，(2)两种蛋白质的结合不能直接结合，第三方在中间充当桥梁；(3)实验前必须预测目标蛋白是什么，以选择最终要检测的抗体。如果预测不正确，实验就不会有结果。三个实验步骤，提取剩余的细胞总蛋白，离心，进行上清液电泳(抗原和抗体)以制备PA珠，进行三次剩余的PBS洗涤，加入剩余的蛋白裂解物(除去非特异性蛋白背景)，离心以除去PA珠，取剩余的上清液，测量蛋白浓度(BCA法)，加入抗反应剂(在4过夜)，加入PA珠捕获复合物(在室温下过夜1小时或4)，离心，收集沉淀，预冷却RIPABuffer次， 装载缓冲液进行悬浮和沉淀，加热游离抗原、抗体和珠子，分析四个实验结果，进行SDS-PAGEWesternblotting分析，进行质谱分析和检测目标蛋白，进行SDS-PAGE结果分析，校准曲线只对同一凝胶上样品的分子量测定可靠。 每种蛋白质的相对迁移率相对于其标准分子量对数绘制成标准曲线，未知蛋白质的分数可以通过测量其迁移率来测量。一级抗体、一级抗体、一级抗体(兔抗肌动蛋白)、暴露蛋白带、二级抗体(辣根标记的山羊抗兔抗体)、ECL、X射线暴露与显影、ECL试剂、含转移蛋白的聚偏氟乙烯膜、转移膜上蛋白检测示意图、白细胞结果分析、一氧化碳-IP和质谱分析过程，这三个实验的重点，1。实验中最重要的一点是抗体的性质。特别是，多克隆抗体的特异性是一个问题。2.为了防止蛋白质分解和修饰，蛋白酶抑制剂必须加入到抗原溶解的缓冲溶液中，并且实验必须在低温下进行。3.考虑抗体/缓冲液比率。如果抗体太少，就不能检测到抗原；如果有太多的抗体，它们不能停留在珠子上并留在上清液中。缓冲液太少不会溶解抗原，而缓冲液太多会稀释抗原。4.确保p？注意问题：1。裂解物，使用温和的裂解条件进行细胞裂解，不能破坏细胞中所有的蛋白质-蛋白质相互作用，大多使用非离子变性剂(NP40或TritonX-100)。每个细胞的裂解条件是不同的，由经验决定。不能使用高浓度变性剂(0.2%SDS)。细胞裂解液中应加入各种酶抑制剂，如商业鸡尾鱼。RIPA莱赛德-普莱莱基因技术有限公司，100毫升，浓度为：50毫摩尔三盐酸(酸碱度7.4)，150毫摩尔氯化钠，1%磷酸-40，0.1%十二烷基硫酸钠。(100元)描述：1。PMSF或其他蛋白酶抑制剂的最终浓度为1毫摩尔，可以在使用前立即新鲜添加到裂解物中。2.2中的蛋白质样本。RIPA裂解物含有高浓度的洗涤剂。不能使用布拉德福方法，但可以使用BCA方法或改良的劳里方法来确定蛋白质浓度和裂解物的组成。家庭医生：细胞裂解物：50毫摩尔-碳氢化合物(lpH7.5)，150毫摩尔氯化钠，0.5%正磷酸盐-40和1毫摩尔乙二胺四乙酸。使用前加入PMSF，直到最终浓度为1 mM。柳岩BC300缓冲液20mM Tris-C1，pH 8.0，300 mM氯化钠，0.2 mM乙二胺四乙酸，10%甘油，0.2mMPMSF，0.2%吐温20，2.1免疫沉淀中抗体的选择，注意：2.2抗体，使用对照抗体：(阴性和阳性)阴性：单克隆抗体：同属的兔抗体多克隆抗体：正常兔抗体阳性：细胞中某一蛋白的抗体(膜蛋白A，膜蛋白B)。未检测到目标蛋白或少量蛋白。可能的原因处理方法1。蛋白酶降解样品：加入蛋白酶抑制剂；所有操作在冰上保持在4以下，防止冻融。2.抗体浓度过低：调整抗体浓度，必要时设置浓度梯度，探索最佳浓度。3.抗抗体亲和力太低：选择适合免疫原性和/或免疫原性的相应抗体。4.免疫球蛋白抗体不与琼脂糖珠结合：选择适合免疫球蛋白的相应珠。妥善保存，防止变质或干燥。标签未暴露在融合蛋白构象表面：改变标签融合表达位点6。溶胞产物刚性太高：使用低刚性的溶胞产物以获得高蛋白质背景：可能的原因处理方法非特异性蛋白质与无血清培养液中的溶胞细胞结合；免疫沉淀前用蛋白珠预洗，免疫沉淀后增加漂洗次数和僵硬度(高盐或洗涤剂)。如果裂解物的严密性太低，使用高严密性的裂解物实验仪器或如果液体被污染，在液体转移膜上使用干净的仪器或非特异性吸附手套，用镊子夹住，不要接触膜