第4章毒作用机制

第四章毒作用机制,本章内容第一节概述第二节毒物对生物膜的损害作用第三节毒物对细胞钙稳态的影响第四节体内生物大分子氧化损伤第五节毒物与细胞大分子的共价结合,第一节概述,1.1基本概念1.2毒作用机制研究内容1.3毒作用机制的意义1.4毒物产生毒性的可能途径,1.1基本概念,毒物毒性的强度主要取决于终毒物在其作用部位的浓度和持续时间。终毒物是最终产生毒性作用的物质。终毒物可以与内源性靶分子相互作用,使整体结构和/或功能改变,从而导致毒性作用。终毒物可以是母体化合物或其代谢产物，也可以是内源性分子。,1.2毒作用机制研究内容,毒作用机制内容包括：毒物如何进入机体？怎样与靶分子相互作用？怎样表现其有害作用及机体对损害作用的反应？等。化学毒物不可逆地影响机体的功能和结构,主要取决于其接触途径和程度。对有害作用的定性和定量研究是评价特定化学毒物潜在危害的基础，对了解毒性机制也较有价值。,1.3毒作用机制的意义,掌握毒物作用机制不仅具有理论意义，且有实际意义,包括：阐明描述性毒性资料；估计毒物所致有害作用的可能性；建立预防或解毒措施；设计危害较小的药物和工业品；开发对靶生物具有高选择性毒性的农药等。毒作用机制的阐明有赖于基础生理和生化过程包括神经传导到DNA修复的深入了解。,1.4毒物产生毒性的可能途径,化学毒物,吸收、分布、代谢、排泄,与靶分子相互作用,细胞功能失调、损伤,细胞修复功能失调,毒性,第二节化学毒物对生物膜的损害作用,本节内容2.1对生物膜组成成分的影响2.2对生物膜上酶活性的影响2.3对生物膜生物物理性质的影响,2.1对生物膜组成成分的影响,维持细胞膜的稳定性对机体内的生物转运、信息传递及内环境稳定是非常重要的。化学毒物可引起膜成分的改变。如：四氯化碳可引起细胞膜磷脂和胆固醇含量下降；二氧化硅可与人红细胞膜的蛋白结合，使其蛋白的-螺旋（二级结构）破坏。,2.2对生物膜上酶活性的影响,化学毒物可影响膜上某些酶的活性而影响细胞的功能。如：有机磷类化合物抑制突触小体和红细胞膜上的胆碱酯酶；对硫磷还可抑制突触小体和红细胞膜上的Ca2+-ATPase和Ca2+,Mg2+-ATPase；苯并芘可抑制红细胞膜Ca2+-ATPase和Na+,K+-ATPase；Pb2+、Cd2+可与Ca2+-ATPase上的巯基结合，而抑制其活性。,2.3对生物膜生物物理性质的影响,生物膜的生物物理性质主要表现在生物膜的通透性、流动性、膜电荷和膜电位等几个方面。2.3.1对膜通透性的影响膜的通透性指膜两侧物质交换的能力。膜的通透性具有选择性，是膜两侧物质转运的基础。,化学毒物可改变膜的通透性而影响膜两侧物质的正常转运，从而影响膜的功能。如：重金属可与膜蛋白结合而改变其结构和功能；缬氨霉素可使膜对K+的通透性增加而造成细胞损伤；DDT可使神经细胞膜通透性改变而使神经兴奋性增高。但是通透性的改变与细胞毒性大小并非绝对相关，因为通透性的改变不是细胞损伤的唯一原因。,氧化磷酸化作用：,当电子流过呼吸链时，质子通过膜被泵出,高H+,低H+,线粒体外膜,线粒体内膜,膜间腔,线粒体基质,H+,Pi+ADP,ATP,线粒体,e,ATP酶复合体,2.3.2对膜流动性的影响,膜的流动性包括：膜脂质分子的旋转、伸缩和振荡、侧向扩散和翻转运动，膜蛋白分子的侧向扩散和旋转运动，膜整体结构的运动。膜流动性的生理意义包括：物质运输、细胞融合、细胞识别、细胞表面受体功能的调节等。膜流动性的改变包括量变（程度变化）和质变（如相变和分相）。化学毒物可通过改变膜的流动性而影响其功能。如：DDT、对硫磷、重金属可使膜的流动性降低；乙醇、溴氰菊酯、二氧化硅可使膜的流动性增高。膜流动性可以通过荧光偏振、核磁共振、激光拉曼光谱、激光漂白荧光恢复法和电镜冷冻蚀刻技术等生物物理实验技术来研究。,膜的流动性,侧向运动,分子的摆动,旋转运动,翻转运动,侧向运动,旋转运动,相变：即膜从液晶相变成凝胶相。分相：即膜脂双层中一部分表现为流动态（液晶态），另一部分表现为固态（结晶态）。,膜脂的相变,相变温度,Tc,脂质,凝固态,液晶态,2.3.3对膜表面电荷的影响,膜表面的糖脂和糖蛋白形成膜表面极性基团，组成表面电荷。膜表面电荷的性质和密度影响膜表面的结构和功能。化学毒物可通过改变膜的表面电荷而影响其结构和功能。,第三节化学毒物对细胞钙稳态的影响,本节内容3.1细胞内钙稳态3.2细胞钙稳态的紊乱与细胞毒性3.3钙稳态失调的机制,3.1细胞内钙稳态,细胞内钙由结合钙（结构钙，储备钙）和游离钙（离子钙，功能钙）组成。正常胞内游离钙的浓度在细胞兴奋时上升至10-5mol/L、静息时下降至10-710-8mol/L。细胞内钙稳态：是指Ca2+i稳态状的变化过程。细胞内钙浓度的调节主要由线粒体和内质网等钙库、其次由细胞质中的缓冲系统（蛋白质、核苷酸、酸性磷脂等）来调节。当内钙调节失灵（钙稳态紊乱）时，即可引起细胞功能损伤及坏死。,细胞钙稳态（calciumhomeostasis）,CaM酶,Ca2+，Mg2+-ATP酶,肌肉收缩蛋白,腺苷酸环化酶,磷酸酯酶,蛋白激酶,离子通道蛋白,Ca2+o=1000M,Ca2+i=0.1M,细胞,“细胞钙稳态”的维持,Ca2+=1000M,Ca2+=0.1M,钙泵,Ca2+,Ca2+,钙通道,蛋白质、核苷酸、酸性磷脂,内质网,线粒体,细胞,钙作为第二信使在细胞功能调节中起重要作用，如神经传导、肌肉收缩、细胞分泌、细胞增殖与分化、细胞形态的变化及细胞衰老等。Ca2+作用途径有：通过钙结合蛋白（如钙调蛋白）介导；通过环磷酸腺苷（cAMP）介导；通过蛋白激酶C（PKC）和磷脂酶C（PLC）介导；通过离子（Ca2+、Na+和Cl）通道介导。,3.2细胞钙稳态的紊乱与细胞毒性,细胞钙稳态紊乱是某些化学毒物中毒的机制之一。如硝基酚、醌、过氧化物、醛类、二噁英、卤化烷烃和烯烃、镉、铅、汞等均能干扰细胞稳态，而引起细胞功能和结构损伤。各种毒物进入机体后，引起细胞内钙过荷时，可激活磷脂酶而促进膜磷脂水解；激活非溶酶体蛋白酶而促进细胞膜骨架蛋白水解；激活核酸内切酶而促进DNA断裂和染色质溶解，从而导致细胞损伤甚至死亡。,3.3钙稳态失调的机制,细胞内钙稳态的失调细胞Ca2+信号的改变在各种病理及毒理学过程中起重要的作用。在细胞受损时可导致Ca2+内流增加，或Ca2+从细胞内贮存部位释放增加，或抑制细胞膜向外逐出Ca2+，表现为细胞内Ca2+浓度不可控制的持续增加，即打破细胞内钙稳态，或称为细胞内钙稳态的失调。Ca2+这种失调或紊乱，将完全破坏正常生命活动所必需的由激素和生长因子刺激而产生的短暂的Ca2+瞬变，危及细胞器的功能和细胞骨架结构，最终激活不可逆的细胞成分的分解代谢过程。这就是所谓中毒机制中钙稳态失调学说。,3.3.1对能量代谢的影响,胞浆内高浓度Ca2+通过单转运器使线粒体Ca2+摄取增加：线粒体膜势能降低而抑制ATP合成酶，结果ATP的合成减少，使细胞膜、内质网上的Ca2+-ATPase及细胞膜上的Na+,K+-ATPase的能量供应减少，细胞内钙泵出减少而使细胞内钙进一步升高；同时线粒体的细胞内呼吸（电子传递）加速，使氧自由基生成增加，膜脂质过氧化。Ca2+也可激活磷脂酶，加速细胞膜脂质的水解。,3.3.2对微管功能的影响,胞浆内钙无控制地升高引起细胞损伤也涉及到微管的解聚,进而损伤细胞的正常形态。细胞通过骨架蛋白的微丝粘附于质膜中的肌动蛋白以维持细胞的正常形态。胞浆内钙的增加使肌动蛋白丝同-辅肌动蛋白和胞衬蛋白分离，促使质膜大疱（细胞膜表面的突出物）的形成而易于破裂。,3.3.3激活水解酶,细胞内Ca2+浓度升高可激活降解蛋白质、磷脂和核酸的水解酶。许多完整的膜蛋白是Ca2+激活的中性蛋白酶或需钙蛋白酶的靶位点。需钙蛋白酶介导的肌动蛋白结合蛋白的水解也可引起膜大疱。钙激活的蛋白酶经蛋白水解可将黄嘌呤脱氢酶转变成次黄嘌呤氧化酶，其副产物氧自由基和过氧化氢可引起细胞损伤。,第四节体内生物大分子氧化损伤,自由基指含一个或多个未配对电子的任何分子或离子。其共同点是具有顺磁性、化学反应性极强、作用半径小、半衰期极短。生物体内自由基有两类：一类是正常参与线粒体电子转运过程的自由基；另一类是自由的非结合状态的并能与各种组织成分相互作用的自由基。,自由基的种类,自由基的种类很多，主要有A、以氧为中心的自由基；B、以碳为中心的自由基；C、以氢为中心的自由基；D、以硫为中心的自由基；E、以氮为中心的自由基；F、过渡金属离子：其中，目前研究最深入的是氧自由基。,常见的自由基,超氧阴离子自由基羟自由基碳酸盐阴离子自由基二氧化氮自由基一氧化氮自由基三氯甲基自由基,氧自由基,含氧的非自由基衍生物,4.1自由基的来源与类型,4.1.1来源（1）正常生理代谢过程线粒体是活性氧的重要来源。活性氧族自由基都是其正常有氧代谢的副产物。生理条件下该自由基可被锰超氧化物歧化酶分解。,细胞内的酶催化的氧化还原反应也是产生自由基的来源。其中主要是黄嘌呤氧化酶，其直接将分子氧还原成过氧化物和过氧化氢或羟自由基。过氧化物酶具有很强的形成过氧化氢能力。过氧化氢可被过氧化氢酶水解产生氧自由基。,（2）外源化合物的作用,外源性化合物可通过各种不同途径产生自由基。其中最主要途径是通过氧化还原反应，通过单电子还原而产生自由基。可发生该反应的外源性化合物包括：醌类：丝裂霉素、阿霉素、博莱霉素等；硝基化合物：苯的硝基化合物（如硝基苯）和硝基杂环化合物（如呋喃妥因）；双吡啶化合物：百草枯、杀草快。此外，有些化学毒物可干扰线粒体的细胞内呼吸功能而产生氧自由基，如：甲基汞、氰化物、3-硝基丙酸。,4.1.2自由基的类型,（1）氧中心自由基该类自由基持续不断地在机体中产生。它们包括氧自由基、羟自由基、过氧化氢、单线态氧、次氯酸等，也包括过氧化物、氢过氧化物及内源性脂质和外来化合物的环氧代谢物。这些物质都含有化学性质活泼的氧功能基团。,（2）其他自由基,除氧中心自由基外，其它有包括：以碳为中心的自由基如三氯甲基自由基；以硫为中心的自由基如烷硫自由基；以氮为中心的自由基如苯基二肼自由基；金属离子（具有接受和供给电子的能力）如：Cu+/Cu2+、Fe2+/Fe3+、Ti()/Ti()。这些金属离子具有接受和供给电子的能力，从而成为自由基反应的重要催化剂。,4.2机体对氧化损伤的防御系统,正常生理条件下，自由基在体内持续不断地产生，但同时被机体内的抗氧化系统清除，从而不致出现损伤。机体内的抗氧化系统包括：非酶抗氧化系统和酶类抗氧化系统。,（1）非酶抗氧化系统,在生物体系中广泛分布着许多小分子，它们能通过非酶促反应而清除氧自由基。谷胱甘肽能与过氧化氢或有机过氧化物作用，可保护细胞免受过氧化物损害，是重要的自由基捕获剂；维生素C能还原氧自由基；维生素E是细胞膜上主要的脂溶性抗氧化剂，通过阻断过氧自由基链反应，防止膜上的多不饱和脂肪酸的氧化；-胡萝卜素是自然界中已知最有效的单线态氧清除剂；尿酸、牛磺酸、次牛磺酸具有防止自由基损伤作用；金属硫蛋白对羟自由基有很强的灭活作用。,（2）酶类抗氧化系统,在生物进化过程中，需氧生物体内存在清除自由基的酶系统。包括：超氧化物歧化酶（SOD）：铜-锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）和锰超氧化物歧化酶（MnSOD）,它们催化超氧阴离子歧化为过氧化氢和氧气；过氧化氢酶：将过氧化氢分解为水和氧气；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，含硒酶）：在GSH存在下，催化过氧化氢和有机氢过氧化物还原为水或醇和水，同时将GSH氧化为GSSG；谷胱甘肽还原酶：在NADPH存在下将GSSG还原为GSH。,4.3自由基对生物大分子的损害作用,当体内自由基的产生超过机体抗氧化防御能力时，即可产生自由基损伤，从而引发疾病或中毒。由氧自由基产生的细胞毒性效应称为氧化应激。自由基对体内生物大分子的损害作用包括：4.3.1脂质过氧化损伤4.3.2蛋白质的氧化损伤4.3.3DNA的氧化损伤,4.3.1脂质过氧化损伤,其主要是生物膜多不饱和脂肪酸的氧化破坏，而破坏膜的结构和功能。脂质过氧化反应是一种链式连锁反应，包括：启动自由基通过脂肪酸的氢抽提而使脂质变性成脂质自由基；发展脂质自由基通过氧固定而连续不断地转化成脂质过氧自由基，通过氢抽提转化成脂质氢过氧化物，进而通过二价铁离子催化转化成脂质烷氧自由基；终止随后的片段产生烃如乙烷、活性醛（如丙二醛）。在此过程中，某一自由基可经多种反应形成另一自由基团，最后形成脂质过氧化自由基和脂质过氧物。,脂质过氧化反应过程：,膜脂质（LH）,脂质自由基（L）,O2,抽氢作用,脂质过氧自由基（LOO）,氢过氧化物（LOOH）,脂质氧自由基（LO）,Fe3+,Fe2+,Fenton反应,环过氧化物自由基,环内过氧化物自由基,丙二醛（MDA）+短链的酮、羧酸或烃类,HO,H2O,分子内双键加成,过氧化作用,LH,L,脂质的过氧化损伤结果：直接结果是使膜PUFA（多不饱和脂肪酸）减少，膜脂流动性降低和膜骨架损伤；过氧化中间产物和终产物引起的膜蛋白共价交联与聚合，影响膜蛋白的构象及其流动性，必然导致膜功能的异常。,4.3.2蛋白质的氧化损伤,自由基对蛋白质的氧化损伤实际是对其氨基酸的氧化作用，尤其是对芳香族和含硫氨基酸。对脂肪族氨基酸的作用的机制可能是在-位置上将一个氢原子除去，形成C-中心自由基，其上再加上氧，生成过氧基衍生物，而后分解成氨和-酮酸或二氧化碳、醛类或羧酸，从而破坏氨基酸的结构。对芳香氨基酸的作用是机制可能是形成羟基衍生物，而后将苯环打开或在酪氨酸处交联成二聚体。,含硫氨基酸的损伤OH可使甲硫氨酸氧化为甲硫氨酸亚砜；使半胱氨酸（Cys）氧化成Cy-S-S-Cy、Cy-SOH及Cy-SO2H。,-NH3+,氧化损伤结果：蛋白质的凝集与交联或降解与断裂。对蛋白质功能影响表现在两个方面：一是直接作用。如酶蛋白分子受到自由基与过氧化降解产物作用，使其功能受损；二是间接作用。当脂质的组分和含量受脂质过氧化的影响，也将间接地影响与膜结合的酶活性。,4.3.3DNA的氧化损伤,自由基引起DNA的损伤是细胞突变或癌变的基础。DNA损伤可引起细胞凋亡。也可因损伤丢失部分碱基或修复时掺入错误的碱基而引起细胞突变和癌变。活性氧可引起DNA碱基损伤、DNA-蛋白质交联物的形成和DNA断裂等。不同活性氧对DNA作用不同：羟自由（OH）基可作用于DNA的所有成分；单线态氧主要作用于DNA中的鸟嘌呤；氧自由基（O2-）可使DNA断裂；过氧化氢（H2O2）只参与DNA损伤过程。,A碱基损伤活性氧攻击DNA的靶位点是腺嘌呤与鸟嘌呤的C8，嘧啶的C5与C6双键。其可能的机制为：氧自由基直接作用于双键部位，使之获得一个加合基而改变其结构。OH使脱氧核苷脱嘌呤，即自由基可使DNA链上出现无嘌呤或无嘧啶部位。OH可以自动从胸嘧啶的甲基中除去H原子。,BDNA链断裂：OH对DNA的攻击，主要针对DNA分子中的核糖部分，可能的位置在DNA分子中核糖的3和4碳位上，造成DNA链的断裂。自由基对胸腺嘧啶碱基作用，造成的损害经修复酶切除，可产生类似的单链断裂。氧化应激可启动细胞内的一系列代谢过程，激活核酸酶，导致DNA链的断裂。,DNA链断裂的后果：可能会造成部分碱基的缺失；修复的DNA可能存在碱基的错误掺入和错误编码；也可能引起原癌基因的活化或抑癌基因的失活等，从而导致细胞的突变或癌变。,第五节毒物与细胞大分子的共价结合,共价结合指毒物或其活性代谢产物与机体内重要的大分子物质（蛋白质、核酸、膜脂质）以共价键结合成稳定的复合物-加合物。共价结合的特点：是永久性地不可逆地改变了内源性分子的结构，从而损伤内源性大分子的功能。由于外源性化合物或其代谢物构成了新生加合物的一部分，可以此作为毒物接触程度的标志物，也有助于中毒的早期诊断和防治。,5.1与蛋白质的共价结合,外源毒物可与蛋白质分子中氨基酸的氨基、羟基、巯基、胍基、咪唑基、吲哚基发生共价结合，从而影响蛋白质的结构和功能。外来化学物与蛋白质相互作用的方式有两种：一是可逆的。如底物与酶蛋白的作用；二是不可逆的。如共价结合成加合物。,蛋白质分子中可与外源化学物共价结合的功能基团：氨基和羧基；Ser（丝氨酸）和Thr（苏氨酸）的羟基；Cys（半胱氨酸）的巯基；Arg（精氨酸）的胍基；His（组氨酸）的咪唑基；Tyr（酪氨酸）的酚羟基；Trp（色氨酸）的吲哚基。,5.1.1与白蛋白的共价结合,白蛋白是血液和组织间质中的主要蛋白质,也是脂肪酸、内源性化合物及外源化合物的主要载体，容易与终致癌物质结合形成共价加合物。血清白蛋白直接由肝细胞合成，同时肝细胞是致癌物质代谢活化的重要部位，因而白蛋白更易接触到肝细胞活化的亲电子性代谢产物。白蛋白加合物形成的量与接触相应毒物的量成正比关系。,5.1.2与血红蛋白的共价结合,外源性化合物进入血液后，先与红细胞膜结合继而进入红细胞内与血红蛋白发生共价结合。血红蛋白氨基酸中的氨基、巯基和芳香胺基团易与外源化合物发生共价结合。因红细胞寿命较长、血样易采集又基本不影响健康，所以血红蛋白共价结合物常作为外源毒物接触人群的生物监测。如：溴甲烷与半胱氨酸、环氧乙烷与缬氨酸和组氨酸、乙烯与组氨酸、环氧丙烷与组氨酸和缬氨酸、丁二烯与缬氨酸、苯胺与半胱氨酸、环氧丙酰胺与缬氨酸、氯乙烯与组氨酸和缬氨酸、丙烯腈和丙烯酰胺与缬氨酸、多环芳烃与氨基酸的羧基等结合。,5.1.3与组织细胞蛋白质的共价结合,进入人体的外源化合物直接或间接通过其活化代谢产物与胞浆、质膜、核内蛋白质结合而形成加合物。如：肝毒性物溴苯可直接消耗具有重要解毒作用的内源性物质谷胱甘肽，其活性代谢物环氧溴苯可与蛋白质发生共价结合，活性代谢物产物二氢二醇可引发自由基反应。有些毒物进入机体后，首先与细胞浆蛋白或核蛋白共价结合，影响细胞的正常代谢过程或信号转导系统。同时，与核蛋白共价结合也必将对细胞生长、繁殖和分化等的调控产生重要影响。,5.2与核酸的共价结合,毒物类型：亲电性代谢产物为主，亲核性代谢产物和自由基也可。结合部位：碱基、核糖或脱氧核糖、磷酸均可，但以碱基损伤的毒理学意义最大。结合后果：细胞突变、癌变及其他一些细胞损伤。,5.2.1毒物与核酸共价结合的意义,毒物与核酸共价结合成不同类型加合物后，引起不同的生物效应，包括细胞毒性、诱变作用、活化癌基因、细胞癌变等。毒物与核酸的共价结合是研究化学毒物致癌作用的热点。一旦毒物与核酸共价结合成加合物，致癌过程即已启动，随后进入促进和发展阶段。,DNA加合物形成是化学致癌过程中一个早期可检测的关键步骤，其可作为接触致癌物的量化标志。DNA加合物也是判断遗传毒性致癌物的生物标志之一。但由于人群及个体差异及接触因素繁多而复杂，要对检测结果作出准确判断存在很大困难。,5.2.2毒物与核酸共价结合的方式,毒物与核酸共价结合形成加合物有两种方式：部分毒物是母体化合物直接与核酸发生共价结合。如烷化剂是带有烷化功能团的化合物，无需代谢即具有亲电子活性，可直接与DNA进行共价结合。大部分毒物需经代谢活化，生成具有活性的代谢物才能与核酸发生共价结合。如多环芳烃类、黄曲霉毒素及芳香胺类。,5.2.3毒物