第三章-生物信息传递(上)-从DNA到RNA

2020/5/27,1,2020/5/27,2,2020/5/27,3,DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成信使RNA、翻译生成蛋白质的过程来控制生命现象。,2020/5/27,4,核糖核酸（RibonucleicAcid,RNA）,RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。,2020/5/27,5,RNA的结构特点,RNA含有核糖和嘧啶，通常是单链线性分子RNA链自身折叠形成局部双螺旋RNA可折叠形成复杂的三级结构,2020/5/27,6,RNA分子来自DNA。储存于DNA双链中的遗传信息通过转录酶促反应按照碱基互补配对的原则被转化成为单链RNA分子。,信使RNA(messengerRNA，mRNA),转移RNA(transferRNA，tRNA),核糖体RNA(ribosomalRNA，rRNA),2020/5/27,7,RNA的功能,作为细胞内蛋白质生物合成的主要参与者部分RNA可以作为核酶在细胞中催化一些重要的反应，主要作用于初始转录产物的剪切加工参与基因表达的调控，与生物的生长发育密切相关在某些病毒中，RNA是遗传物质,2020/5/27,8,转录(transcription):是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下，以4中NTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。,有义链又称编码链codingstrand:指不作模板的DNA单链,反义链又称模板链templatesrand:指作为模板进行RNA转录的链,2020/5/27,9,在依赖DNA的RNA聚合酶作用下进行转录AU、CG合成RNA分子转录合成RNA链的方向为53，模板单链DNA的极性方向为35，而非模板单链的极性方向与RNA链相同，均为53。（书写）基因转录方式为不对称转录(一条单链DNA为模板,RNA聚合酶的结合)RNA转录与DNA复制比较有何异同？,转录的特点,2020/5/27,10,模板链并非永远在同一条单链上,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。,结构基因：,2020/5/27,11,转录单元（transcriptionunit）,转录单元：一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。终止子：染色体上提供终止信号而使转录终止的一段核苷酸短序列。,2020/5/27,12,转录(transcription),基因表达,翻译(translation),拷贝出一条与DNA链序列完全相同(U替换T)的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤；,以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。,2020/5/27,13,ATGC,2020/5/27,14,第一节RNA转录的基本过程第二节转录机器的主要成分第三节启动子与转录的起始第四节原核生物与真核生物mRNA特征的比较第五节终止与抗终止第六节内含子的剪切、编辑及化学修饰,2020/5/27,15,第一节RNA转录的基本过程,一、转录的基本过程,模板的识别转录的起始转录的延伸转录的终止,2020/5/27,16,模板识别RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程.启动子(promoter)DNA：模板上专一地与RNA聚合酶结合并决定转录从何处起始的部位，也决定基因的转录效率。转录起点即转录原点记为1，其5上游记为负值，下游记为正值。,转录的起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应的DNA链上的碱基，研究表明通常为一个嘌呤（A或）。,转录泡：RNApol结合和转录的DNA模板区域，有17bp左右DNA形成解链区,2020/5/27,17,启动子(promoter),指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点(频率、效率),2020/5/27,18,模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。,转录起始前，启动子附近的DNA双键分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。,在原核生物中,2020/5/27,19,聚合酶-启动子可逆性结合形成封闭二重复合体；封闭复合体转变为开放复合体；整合进最初两个核苷酸，形成一个磷酸二酯键，形成三重复合体；,转录的起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。,原核生物转录的起始（三个阶段）,2020/5/27,20,真核生物转录的起始,真核生物有三种RNA聚合酶，分别催化不同RNA的合成，每种酶的作用均需一些蛋白辅助因子的参与，将这些因子称为转录因子。,转录因子的命名冠以聚合酶的名称，如RNA聚合酶II所需的转录因子称为转录因子II（transcriptionfactorII,TFII)。,TFs帮助RNA聚合酶识别启动子。TFs(转录因子）必须先与DNA形成复合物，帮助RNA聚合酶定位到转录起始的位点。RNA聚合酶和转录因子在DNA上的定位形成前起始复合物，由于转录因子的作用复合物由封闭型转换成开放型。,2020/5/27,21,通过启动子阶段,转录起始后直到形成9个核苷酸短链,此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进人正常的延伸阶段。,所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。一般说来，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。,2020/5/27,22,转录的延伸,RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程,在37时，大肠杆菌RNA聚合酶完成该反应的速度为每秒40个核苷酸。,2020/5/27,23,RNA链的延伸图解,2020/5/27,24,转录的终止,当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来,RNA聚合酶释放,RNA链释放,DNA恢复成双螺旋状态,2020/5/27,25,终止子（terminator，t）强终止子内部终止子（不依赖Rho()因子的转录终止。）弱终止子需要因子（rhofactor）又称为依赖性终止子（Rho-dependentterminator）,2020/5/27,26,（）强终止子不依赖因子的终止,终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，RNA形成发夹结构；,在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，RNA的3端为寡聚U。,2020/5/27,27,发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。,终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度效率,2020/5/27,28,（）弱终止子依赖因子的终止,因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。,2020/5/27,29,复制转录模板两股链模板链（反义链）原料dNTPNTP配对A-T,G-CA-U,G-C聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶产物半保留DNA三种RNA,转录与复制的区别,2020/5/27,30,RNA合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子,终止子,识别,（-dependentterminator）；,2020/5/27,31,真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要转录调控因子(辅助蛋白质)按特定顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物。,转录和翻译的速度基本相等，37时，转录生成mRNA的速度每秒钟合成14个密码子，而蛋白质合成的速度大约是每秒钟15个氨基酸。,2020/5/27,32,第二节转录机器的主要成分,一、RNA聚合酶,原核和真核生物的RNA在分子组成、种类和生化特性上各有特色。,不需要任何引物,RNA或RNA-DNA双链杂合体不能作为模板,2020/5/27,33,3.2.1原核生物的RNApolymerase(E.coli),1、全酶(HoloEnzyme)和核心酶(CoreEnzyme),2020/5/27,34,原核生物的RNA聚合酶(DDRP)E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（2）,起始因子,2020/5/27,35,RNA聚合酶全酶及核心酶电泳图谱,2020/5/27,36,(1)全酶（HoloEnzyme）用于转录的起始依靠空间结构与DNA模板结合(与核心酶结合后引起的构象变化)专一性地与DNA序列(启动子)结合结合常数：1014mol半衰期：数小时（107mol）转录效率低，速度缓慢（的结合）,2020/5/27,37,（2）核心酶（CoreEnzyme）作用于转录的延伸过程（终止）依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间）非专一性的结合（与DNA的序列无关）结合常数：1011mol半衰期：60秒,2020/5/27,38,此外，新发现的一种亚基的功能尚不清楚。2、各亚基的特点和功能（1）因子因子可重复使用修饰RNApol构型使HoloEnzyme识别启动子的SextamaBox(35区),并通过与模板链结合,2,2,2,2,（3）全酶的组装过程,2020/5/27,39,不同的因子识别不同的启动子E.coli中有四种因子（70、32、54、28）枯草杆菌中有11种因子（因子的更替对转录起始的调控）（2）因子,核心酶的组建因子,促使RNApol与DNA模板链结合,前端因子使模板DNA双链解链为单链尾端因子使解链的单链DNA重新聚合为双链,2020/5/27,40,（3）因子,完成NMP之间的磷酸酯键的连接Editing功能（排斥与模板链不互补的碱基）与Rho（）因子竞争RNA3end,2020/5/27,41,Esite（elongationsiteRifR）:对NTP非专一性地结合（催化作用和Editing功能）,（4）因子参与RNA非模板链（sensestrand）的结合（充当SSB）,构成Holoenzyme后，因子含有两个位点Isite（initiationsite.Rifs）:该位点专一性地结合ATP或者GTP（需要高浓度的ATP或GTP）,2020/5/27,42,由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点,有义DNA链结合位点（亚基提供）DNA/RNA杂交链结合位点（亚基提供）双链DNA解链位点（前端亚基提供）单链DNA重旋位点（后端亚基提供）因子作用位点,2020/5/27,43,E.coliRNApolymerase,用于起始和延伸,只用于起始,36.5KD,36.5KD,151KD,155KD,11KD,70KD,2020/5/27,44,P82表3-2,2020/5/27,45,每个细胞中约有7000个RNA聚合酶分子,每一时刻有20005000个酶在执行转录DNA模板的功能,因子大大增加聚合酶对启动子的亲和力，并降低酶对非专一位点的亲和力，使酶专一性识别模板上的启动子,2020/5/27,46,当新生RNA链达到69个核苷酸时，能形成稳定的酶DNARNA三元复合物，并释放因子，转录进人延伸期,2020/5/27,47,当聚合酶按53方向延伸RNA链时，解旋的DNA区域也随之移动。聚合酶可以横跨约40个碱基对，而解旋的DNA区域大约是17个碱基对。自由核苷酸能被聚合酶加到新生的RNA链上，并形成DNA-RNA杂合体。随着聚合酶在模板上的运动，靠近3端的DNA不断解旋，同时在5端重新形成DNA双链，将RNA链挤出DNA-RNA杂合体。RNA的3端大约有2030个核苷酸与DNA和聚合酶相结合。,2020/5/27,48,3.2.2真核生物的RNApol1、三种RNApol：根据对-鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类RNApol最不敏感（动、植、昆）RNApol最敏感RNApol不同种类的敏感性不同2、位置和转录产物RNApol核仁活性所占比例最大转录rRNA（5.8S、18S、28S）,2020/5/27,49,RNApol核质主要负责hnRNA、snRNA的转录hnRNA（mRNA前体，核内不均一RNAheterogeneousnuclearRNA）snRNA（核内小分子RNAsmallnulearRNA，参与RNA的剪接)RNApol核质负责tRNA、5SrRNA、Alu序列和部分snRNA目前在线粒体和叶绿体内发现少数RNApol（活性较低）,2020/5/27,50,真核生物线粒体和叶绿体中还存在着不同的RNA聚合酶。,线粒体RNA聚合酶只有一条多肽链，相对分子质量小于7x104，是已知最小的RNA聚合酶之一，与T7噬菌体RNA聚合酶有同源性,叶绿体RNA聚合酶比较大，结构上与细菌中的聚合酶相似，由多个亚基组成，部分亚基由叶绿体基因组编码,2020/5/27,51,3、亚基组成：分子量500KDa,含两个大亚基和712个小亚基RNApol：大亚基中有C末端结构域(carboxyterminaldomainCTD)CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复TyrSerProThrSerProSerC端重复七肽不同生物中重复数目不一样（酶活性）,2020/5/27,52,CTD中的Ser和Thr可被高度磷酸化磷酸化的RNApol被称为A非磷酸化的RNApol称为BCTD参与转录BA使RNApol易于离开启动子进入延伸过程（10倍）,2020/5/27,53,真核生物中共有3类RNA聚合酶，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同。真核生物RNA聚合酶一般有816个亚基所组成，相对分子质量超过5105。,聚合酶中有两个相对分子质量超过l105的大亚基；,同种生物3类聚合酶有共享小亚基的倾向，即有几个小亚基是其中3类或2类聚合酶所共有的,3类聚合酶的亚基种类和大小存在两条普遍遵循的原则,2020/5/27,54,3.2.3转录复合物,启动子选择阶段,RNA聚合酶全酶对启动子的识别,聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closedcomplex）,伴随着DNA构象上的重大变化，封闭复合物转变成开放复合物(opencomplex),p75,2020/5/27,55,开放复合物与最初的两个NTP相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后(RNA聚合酶、DNA和新生RNA)三元复合物。,强启动子,封闭复合物开放复合物（不可逆的快反应）,真核生物转录起始复合物的分子量很大：RNA聚合酶、7种辅助因子（包含多个亚基）。,2020/5/27,56,三元复合物可以进入两条不同的反应途径,一是合成并释放29个核苷酸的短RNA转录物流产式起始;,二是尽快释放亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物,2020/5/27,57,转录的真实性取决于,有特异的转录起始位点,转录起始后按照碱基互补原则准确地转录,模板DNA序列及具有特异的终止部位,因子,2020/5/27,58,只有带因子的全酶才能专一地与DNA上的启动子结合，选择其中一条链作为模板，合成均一的产物。因子的作用只是起始而已，一旦转录开始，它就脱离了起始复合物，而由核心酶负责RNA链的延伸。,因此，聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始，而核心酶的作用是链的延伸。,2020/5/27,59,终止信号,较稳定,2020/5/27,60,转录的起始过程,核心酶,1217bp,2020/5/27,61,2020/5/27,62,原核生物的转录与翻译同时进行,实际上在原核生物中，RNA的转录、蛋白质的合成以及mRNA的降解通常是同时进行的。因为在原核生物中不存在核膜包裹的细胞核。另外，RNA的转录和多肽链的合成都是从5向3方向进行，只要mRNA的5端合成后，即可以开始蛋白质的翻译过程。在原核生物中mRNA的寿命一般只有几分钟。因此，往往在3端mRNA的转录还没有最后结束，5端mRNA在完成多肽链的合成后，已经开始降解。,2020/5/27,63,小结,一、转录的基本过程,模板的识别转录的起始转录的延伸转录的终止,二、转录的主要机器,RNA聚合酶,转录复合物,原核生物,真核生物,核心酶,因子,封闭二重复合体,开放二重复合体,三重复合体,转录延伸复合物,2020/5/27,64,第二节启动子与转录起始,大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相互作用主要包括,2020/5/27,65,一、启动子区的基本结构启动子（promoter）：是一段位于结构基因5端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。,2020/5/27,66,转录单元（transcriptionunit）：是一段从启动子开始到终止子结束的DNA序列，RNA聚合酶从转录起始位点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。转录起始位点：是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。,2020/5/27,67,转录单元（transcriptionunit）,起点（startpoint）上游（upstream）下游（downstream）,2020/5/27,68,Templatestrand,Transcription,Codingstrand,Transcriptionalstartsite,+1,35sequence,10sequence,Promoter,G,T,C,A,T,A,C,G,A,T,A,T,T,A,T,A,T,A,T,A,A,T,A,T,A,T,3,5,5,5,3,3,RNA,A,AProkaryoticPromoter,2020/5/27,69,启动子区的基本结构,细菌启动子特征：1、起点通常是一个嘌呤；2、起点上游10bp处，有一约5bp的保守区域，称为-10区（也叫PribnowBox），共有序列为：T80A95T45A60A50T96；3、起点上游35bp处，有一约6bp的保守区，称为-35区，共有序列为：T82T84G78A65C54A45；4、90%的启动子中，-10与-35区的距离在16-19bp之间；两个保守区之间的序列并不重要，但距离很关键。,2020/5/27,70,RNA聚合酶保护法,2020/5/27,71,开始转录,TTGACAAACTGT,-35区,TATAATPuATATTAPy,-10区,原核生物启动子保守序列,2020/5/27,72,2020/5/27,73,TTGACA区：提供了RNA聚合酶全酶识别的信号,TATA区：酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）,这两个区域是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与因子相互识别而具有很高的亲和力。,2020/5/27,74,-35-10转录起点TTGACA16-19bpTATAAT5-9b,典型启动子的结构,2020/5/27,75,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,2020/5/27,76,TATAbox：位于RNA聚合酶II转录起点上游约-35-25bp处的共同序列TATAAA，绝大多数情况下全部是A-T碱基对，只有少数含有G-C。CAATbox：在起点上游-78-70bp处还有另一段共有序列CCAAT，称为CAAT区。GCbox：在起点上游-110-80bp处有一段富含GC碱基对的序列（GCCACACCC或GGGCGGG），称为GC区。增强子：能强化转录起始频率的DNA序列。,真核生物基因中启动子特征：,2020/5/27,77,真核生物启动子,2020/5/27,78,二、启动子区的识别,在启动子区DNA双螺旋结构中，腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶上的某些基团是氢键供体，而4种碱基中的某些基团是氢键受体。由于它们分别处于DNA双螺旋的大沟或小沟内，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有处于特定空间构象的氢键受体与供体，当它们与启动子中对应的分子在一定距离内互补时，就形成氢键，相互结合。,RNA聚合酶不直接识别碱基对本身，是通过氢键互补的方式识别启动子的,2020/5/27,79,三、RNA聚合酶与启动子区的结合,在RNA聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链DNA相结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开链复合物。解链区一般在-9+13之间，而酶与启动子结合的主要区域在其上游。,2020/5/27,80,一旦开链区解链，酶分子能以正确的取向与解链后的有关单链相互作用，形成开链复合物。因此，RNA聚合酶既是双链DNA结合蛋白，又是单链DNA结合蛋白。DNA开链是按照DNA模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。,2020/5/27,81,图3-16p88,2020/5/27,82,四、-10区和-35区的最佳间距,在原核生物中，-35区与-10区之间的距离大约是1619bp,保持启动子这二段序列以及它们之间的距离都是重要的，否则就会改变它所控制基因的表达水平。,小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性,2020/5/27,83,因为增减bp，-35区相对于-10区旋转（增减一个bp会使两者之间的夹角发生36的变化）所产生的超螺旋会发生改变。若要使酶与DNA在这个区域内保持正确的取向，就必须使二者之一发生扭曲，需要增加结合自由能。,2020/5/27,84,如果把Pribnow区从TATAAT变成AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水平;,增加Pribnow区共同序列的同一性。例如，在乳糖操纵子的启动子中，将其Pribnow区从TATGTT变成TATATT，就会提高启动子的效率，提高乳糖操纵子基因的转录水平。,2020/5/27,85,五、增强子及其功能,增强子的发现从SV40开始，在SV40的转录单元上发现它的转录起始位点上游约200bp处有两段72bp长的重复序列，它们不是启动子的一部分，但能增强或促进转录的起始，除去这两段序列会.若保留其中一段或将之取出插至DNA分子的任何部位，就能,2020/5/27,86,这种能强化转录起始的序列为增强子或强化子(enhancer)。后来在许多基因的启动区中陆续发现了增强子的存在。,2020/5/27,87,把-珠蛋白基因置于带有上述72bp序列的DNA分子上，发现它在体内的转录水平提高了200倍。而且，无论把这段72bp序列放在转录起点上游1400bp或下游3300bp处，它都有转录增强作用。增强子通过影响染色质DNA-蛋白质结构并改变超螺旋而改变模板的整体结构，使得RNA聚合酶更容易与模板DNA相结合，起动基因转录。,2020/5/27,88,六、真核生物启动子对转录的影响,启动子是确保转录精确而有效地起始的DNA序列。1979年，美国科学家Goldberg首先注意到真核生物中，由RNA聚合酶II催化转录的DNA序列5上游区有一段与原核生物Pribnow区相似的富含TA的保守序列。由于该序列前4个碱基为TATA，所以又称为TATA区(TATAbox)。,2020/5/27,89,此后10多年间，科学家通过对许多基因启动子区的分析，发现绝大多数功能蛋白基因的启动子都具有共同的结构模式。简单地说，真核基因的启动子在-25-35区含有TATA序列，在-70-80区含有CCAAT序列(CAATbox)，在-80-110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列(GCbox)。TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件(upstreampromoterelement，UPE)或称上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)。,2020/5/27,90,原核和真核基因转录起始位点上游区的结构存在很大的差别。,原核基因启动区范围较小，TATAAT(Pribnow区)的中心位于-10，上游只有TTGACA区(-35区)作为RNA聚合酶的主要结合位点，参与转录调控;真核基因的调控区较大，TATAA/TA区位于-20-30，而-40-110区为上游激活区。,真核基因除了含有可与原核基因启动子相对应的CAAT区（7078区）之外，大多数基因还拥有GC区和增强子区。,2020/5/27,91,TATA区和其他两个上游启动子元件（GAAT区或GC区）的作用有所不同。,主要作用是使转录精确地起始，如果除去TATA区或进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如CAAT区或GC区突变后明显，但发现所获得的RNA产物起始点不固定,CAAT区或GC区是决定转录产物产率高低的,2020/5/27,92,CAAT区和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。CAAT区对转录起始频率的影响最大，该区任一碱基的改变都将极大地影响靶基因的转录强度，而启动区其他序列中一两个碱基的置换则没有太大的影响。在TATA区和相邻的UPE区之间插入核苷酸也会使转录减弱。,2020/5/27,93,尽管这3种启动子区序列都有着重要功能，但并不是每个基因的启动子区都包含这3种序列。有些基因，如SV40的早期基因，缺少TATA和CAAT区，只有6个串联在上游-40-110位点的GC区;有些基因，如组蛋白H2B，不含GC区，但有两个CAAT区，一个TATA区。,2020/5/27,94,真核细胞中存在着大量特异性或组成型表达的、能够与不同基因启动子区UPE相结合的转录调控因子。基因转录实际上是RNA聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。,2020/5/27,95,小结：不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同。不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交启动子功能没有变化。各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，组成起始复合物，蛋白因子间的相互作用决定了转录的起始。,2020/5/27,96,第四节原核生物与真核生物mRNA的特征比较,mRNA在大肠杆菌细胞内占总RNA的2%左右(tRNA占16%，而rRNA则占80%以上)。,直到20世纪70年代初才首次将这一重要物质从细胞中分离出来。,2020/5/27,97,现已清楚，许多基因的mRNA在体内还是相当稳定的，半衰期从几个小时到几天不等。目前，人们己能从几乎所有生物体内分离纯化编码任何蛋白质的mRNA。,2020/5/27,98,mRNA在所有细胞内执行着相同的功能，即通过密码三联子翻译生成蛋白质，但其生物合成的具体过程和成熟mRNA的结构在原核和真核细胞内是不同的。真核细胞mRNA最大特点在于它往往以一个较大相对分子质量的前体RNA出现在核内，只有成熟的、相对分子质量明显变小并经化学修饰的mRNA才能进入细胞质参与蛋白质的合成。,真核细胞mRNA的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内,2020/5/27,99,原核生物中，mRNA的转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里，而且这两个过程几乎是同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开始转录时就被引发,一个原核细胞的mRNA(包括病毒)有时可以编码几个多肽，而一个真核细胞的mRNA最多只能编码一个多肽,原核生物常以AUG作为起始密码子，有时GUG或UUG也作为起始密码子；真核生物几乎永远以AUG作为起始密码子,2020/5/27,100,一、原核生物mRNA的特征,细菌基因的转录与翻译是紧密相联的，基因转录一旦开始，核糖体就结合到新生mRNA链的5端，启动蛋白质合成，而此时该mRNA的3端还远远没有转录完全。在电子显微镜下，我们可以看到一连串核糖体紧紧跟在RNA聚合酶后面。,1.原核生物mRNA的半衰期短,2020/5/27,101,绝大多数细菌mRNA的半衰期很短，mRNA的降解紧随着蛋白质翻译过程发生。转录开始1min后，降解就开始了，当一个mRNA的5端开始降解时，其3端部分仍在合成或被翻译。mRNA降解的速度大概是转录或翻译速度的一半。,2020/5/27,102,因为基因转录和多链肽延伸的速度基本相同，所以细胞内某一基因产物(蛋白质)的多少决定于转录和翻译的起始效率，以大肠杆菌色氨酸合成酶基因为例，平均每分钟约有15次转录起始，这些mRNA链从生成到降解平均被翻译10次，所以，稳定状态下细胞中每分钟生成150个多肽。我们所讨论的mRNA的半衰期只是统计学上的平均值。,2020/5/27,103,细菌mRNA可以同时编码不同的蛋白质。编码多个蛋白质的mRNA为多顺反子mRNA。多顺反子mRNA是一组相邻基因的转录产物。这一组基因被称为一个操纵子。单顺反子mRNA为只编码一个蛋白质的mRNA。,2、许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在,2020/5/27,104,所有mRNA都被分成3部分:编码区、位于AUG之前的5端上游非编码区以及位于终止密码子之后不翻译的3端下游非编码区。编码区始于起始密码子AUG，经一连串编码氨基酸的密码子直至终止密码子。对于多顺反子mRNA中的第一个顺反子来说，一旦mRNA的5端被合成，翻译起始位点即可与核糖体相结合，而后面几个顺反子翻译的起始就会受其上游顺反子结构的调控。,2020/5/27,105,情况一,第一个蛋白质合成终止以后，核糖体分解成大、小亚基，脱离mRNA模板，第二个蛋白的翻译必须等到新的小亚基和大亚基与该蛋白起始密码子相结合后才可能开始,2020/5/27,106,情况二,前一个多肽翻译完成以后，核糖体大、小亚基分离，小亚基不离开mRNA模板，而是迅速与游离的大亚基结合，启动第二个多肽的合成,2020/5/27,107,在噬菌体RNA中，一个顺反子的翻译有时完全取决于它前面顺反子的翻译，因为噬菌体RNA往往形成复杂的二级结构，只有第一个翻译起始位点是暴露的，在这个顺反子翻译产生多肽的过程中，核糖体的运动破坏了后续顺反子的二级结构，才使起始位点较容易与核糖体相结合形成起复合物,2020/5/27,108,2020/5/27,109,3、原核生物mRNA的5无帽子结构，3端无或者只有较短的poly(A)结构,AUG上游712个核苷酸处有一段被称为SD序列的保守区,2020/5/27,110,原核细胞mRNA的结构特点,5,3,先导区,AGGAGGU,SD区,一条mRNA链编码几种功能相关的蛋白质,位于mRNA编码区上游的一个短片段，由10个碱基组成（5AAACAGGAGG3），称为SD顺序，与30S小亚基中的16SrRNA3端的六碱基顺序（3UCCUCC5）顺序互补，这意味着核糖体能选择正确的AUG密码来起始蛋白质的合成。,2020/5/27,111,S-D序列,2020/5/27,112,二、真核生物mRNA的特征,凡是编码功能蛋白的真核基因都通过RNA聚合酶进行转录。,真核基因几乎都是单顺反子，只包含一个蛋白质的信息，其长度在几百到几千个核苷酸之间。,一个完整的基因，不但包括编码区(codingregion)，还包括不编码氨基酸的5和3端的特异性序列。,2020/5/27,113,基因的分子生物学定义是,产生一条多肽链的功能RNA所必需的全部DNA核苷酸序列!,2020/5/27,114,真核生物的mRNA(不包括叶绿体和线粒体)5端都是经过修饰的，基因转录一般从A起始，第一个核苷酸保留了5端的三磷酸基团并能通过其3-OH位与下一个核苷酸的5磷酸基团形成二酯键，转录产物的起始序列为pppApNpNp,1、真核生物mRNA的5端的帽子,2020/5/27,115,然而，如果在体外用核酸酶处理成熟mRNA;其5端并不产生预期的核苷三磷酸，而产生以55三磷酸基团相连的二核苷酸，5终端是一个在mRNA转录后加上去的甲基化鸟嘌呤。,2020/5/27,116,2020/5/27,117,mRNA5端加“G”的反应是由腺苷酸转移酶完成的，这个反应非常迅速，很难测得5自由三磷酸基团的存在。据测算，在新生mRNA链达到50个核苷酸之前，帽子结构就已加到mRNA的第一个核苷酸上了。即mRNA几乎一诞生就是戴上帽子的。新加上的G与mRNA链上所有其他核酸苷方向正好相反，像一顶帽子倒扣在mRNA链上。,2020/5/27,118,一般认为，帽子结构是GTP和原mRNA5端三磷酸腺苷（或鸟苷）缩合反应的产物。,2020/5/27,119,mRNA的帽子结构常常被甲基化。第一个甲基出现在所有真核细胞的mRNA中，称为零号帽子(cap0),第二个核苷酸(原mRNA5第一位)的2-OH位上加另一个甲基。有这个甲基的结构称为1号帽子(cap1)，真核生物中以这类帽子结构为主,在某些生物细胞内，mRNA链上的第三个核苷酸的2-OH位也可能被甲基化，被称为2号帽子（cap2），占有帽mRNA总量的10%15%。,2020/5/27,120,帽子结构的功能,免遭核酸酶的破坏,容易被蛋白质合成的起始因子所识别,翻译所必须，甲基化的帽子结构是蛋白质合成起始信号的一部分,2020/5/27,121,除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3末端都有poly(A)序列，其长度因mRNA种类不同而变化，一般为40200个。poly(A)序列是在转录后加上去的，是在细胞核中的不均一核RNA阶段加上的。,2、多数真核生物mRNA有poly(A)尾巴,2020/5/27,122,真核基因的3末端poly(A)起始位点上游1530bp处有一段保守序列AAUAAA，这对于初级转录产物的准确切割及加poly(A)是必需的。点突变实验将AAUAAA的基因序列变为AAGAAA，发现mRNA的剪接加工受阻，没有功能性mRNA产生。,2020/5/27,123,RNA聚合酶是真核细胞核中转录RNA的酶。RNA聚合酶在poly(A)起始位点不终止而继续转录，大部分基因的初级转录产物拥有poly(A)位点下游0.52kb核苷酸序列。加poly(A)时需要由内切酶切开mRNA3端的特定部位，然后由poly(A)合成酶催化多聚腺苷酸的反应。,2020/5/27,124,2020/5/27,125,2020/5/27,126,poly(A)尾巴的功能,是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式，提高了mRNA在细胞质中的稳定性,广泛应用于分子克隆。常用寡聚dT片段与mRNA上的poly(A)相配对，作为反转录酶合成第一条cDNA链的引物,2020/5/27,127,大部分真核mRNA有poly(A)尾巴，细胞中还有1/3没有poly(A)的mRNA，带有poly(A)的mRNA称为poly(A)+，而把没有poly(A)的mRNA称为poly(A)。约1/3的poly(A)mRNA编码了不同形式的组蛋白，其余2/3的poly(A)mRNA带有与poly(A)+组分相同的遗传信息。,2020/5/27,128,真核细胞mRNA的结构特点,m7G-5ppp-N-3p,AAAAAAA-OH,一条mRNA链只能为一种蛋白质编码,2020/5/27,129,小结,一、原核生物mRNA的特征：,半衰期短,许多mRNA以多顺反子的形式存在,二、真核生物mRNA的特征,5端存在“帽子”结构,3端存在poly(A)尾巴,无帽子和尾巴结构,2020/5/27,130,第五节终止和抗终止,大肠杆菌的终止子,不依赖于因子的终止,依赖于因子的终止,p78,2020/5/27,131,一、不依赖于因子的终止,合成的RNA尾部的序列特征：1、二重对称的序列形成发卡结构；在发卡结构的茎基部富含G-C对；发卡结构可减缓或暂停合成；2、尾部有约48个连续的U；连续的A-U对使杂交链更容易分离。,2020/5/27,132,2020/5/27,133,先结合于终止区上游；沿RNA链移动；RNA聚合酶在终止子处暂停；因子追上聚合酶并使之解离，并拆分RNA-DNA杂交链。,二、依赖因子的终止,2020/5/27,134,三、抗终止,1、破坏终止位点RNA的茎环结构,在原核生物中，转录和翻译相偶联。当介质中氨基酸减少时，相对应的携带这种氨基酸的tRNA也减少，使得核糖体不能顺利通过串联密码子，而破坏了mRNA的茎环结构，使得转录不能终止。,2020/5/27,135,2、依赖于蛋白质因子的转录抗终止,噬菌体中的N蛋白具有抗转录终止的作用。,随后NusG，S10，NusB都结合在Nut位点，形成复合物，使RNA聚合酶构象改变，对终止信号不敏感，使RNA链的合成继续。,2020/5/27,136,第六节内含子的剪接、编辑及化学修饰,3.6.lRNA中的内含子真核基因表达往往伴随着RNA的剪接过程,从mRNA前体分子中切除被称为内含子(intron)的非编码区，并使基因中被称为外显子(exon)的编码区拼接形成成熟mRNA。,2020/5/27,137,2020/5/27,138,真核基因大多是断裂的，即一个基因可由多个内含子和外显子间隔排列而成。,内含子在真核基因中所占的比例很高，可超过99%。,2020/5/27,139,2020/5/27,140,2020/5/27,141,不连续基因（interrupted/discontinuousgene，splitgene，断裂基因）真核生物基因除了与mRNA相对应的编码序列外，还含有一些不编码的序列插在编码序列之间。这些序列在加工为成熟的mRNA时被去除。,外显子（exon）：基因中与mRNA一致的序列。一个基因总是以外显子为起点和终点。内含子（intron）：基因中编码序列之间的介入序列，在原初转录物加工为mRNA时被去除。,2020/5/27,142,（一）真核生物mRNA的转录后的修饰1、加帽（5端）2、加尾polyA（3端）3、剪接断裂基因、外显子和内含子,切除,连接,帽,polyA,转录后的修饰,2020/5/27,143,2020/5/27,144,2020/5/27,145,真核基因平均含有8个内含子，hnRNA410mRNA,不同生物细胞内含子的边界处存在相似的核苷酸序列,GU-AG（主要）,AU-AC（次要）,2020/5/27,146,内含子两端没有长的同源或互补序列，但有极短的保守的共有序列，左端（上游）为GU，右端（下游）为AG。这一现象称为GU-AG规则。,左端的位点也叫供体位点（donorsite）或者5，右端也叫受体位点（acceptorsite）或者3。,2020/5/27,147,2020/5/27,148,3.6.2RNA的剪接,许多相对分子质量较小(106185bp)的核内RNA(如Ul，U2，U4，U5和U6)以及与这些RNA相结合的核蛋白(被称为snRNPs，ribonucleoproteinparticle)参与RNA的剪接。,2020/5/27,149,UlsnRNA以碱基互补的方式识别,U2AF识别并引导U2snRNP与分支点相结合,进一步与U4、U5、U6snRNP三聚体相结合，形成60S的剪接体，进行RNA前体分子的剪接,2020/5/27,