第二章-蛋白质分子设计

第二章蛋白质分子设计ChaptertwoProteinDesign,引言,在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务：酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子；抗体起到防护的作用;从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质:生物合成不需要消耗很多能量专一性很强不产生副作用并且能很快降解,蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因:(1)蛋白质分子量非常大(10000-1000000)，不能通过化学方法生产;(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的;(3)专一性致使其应用范围受到影响。,蛋白质应用受限的原因,蛋白质设计目前存在的问题1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性2、三级结构的确定性较差,第一节蛋白质分子设计原理,蛋白质分子设计的流程,天然蛋白质,蛋白质结构预测,蛋白质晶体学,蛋白质三维结构,结构与功能的关系,蛋白质突变体设计及结构预测,几何优化及蛋白质动力学研究,结果分析与原先的结构比较,蛋白质合成定位突变,分离、纯化及表征,新蛋白质,数据的输入,Pr突变体设计的3个步骤,利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的aa,利用能量优化及动力学方法预测修饰后的蛋白质结构,预测的结构与原始的Pr结构比较，利用Pr结构-功能或结构稳定相关知识及理论计算机预测新Pr可能具有的性质,在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新Pr；Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合,在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新Pr；Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合,蛋白质分子设计原理,内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）Pr内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子可以结合一个水分子或惰性气体），没有重叠所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所取代疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力,蛋白质分子设计原理,金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。对于金属Pr，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主链的相互作用。最优的aa侧链几何排列。Pr侧链构象由空间两个立体因素所决定(一是立体势垒，二是aa的位置)结构及功能的专一性。这是Pr设计最困难的问题,一、蛋白质分子设计的分类,设计的目的主要有两个：一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性等；二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。,（一）蛋白质分子设计的层次,分为两个层次：一是在蛋白质三维结构已知基础上的分子设计；二是在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工作。,（二）蛋白质分子设计的分类,1定点突变或化学修饰法2拼接组装设计法3从头设计全新蛋白质,二、蛋白质分子设计的原则,1活性设计2对专一性的设计3Scaffold设计(框架)4疏水基团与亲水基团需合理分布5最优的氨基酸侧链几何排列,溶菌酶结构,例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子的设计过程中，其中EFAEEAASF多肽能水解几丁质和葡聚糖，但糖苷酶活性较低。Cutte成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的34肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚体；而天然核酸酶仅消化polyC、polyU、polyA，特别倾向于水解polyC的3端。,设计步骤,序列设计,设计螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成螺旋的残基；设计全结构时，应选择Val、Ile等易于形成折叠片的残基；而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。,第二节基于天然蛋白质结构的分子设计,基于天然蛋白质结构的分子设计有两类：一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，即“小改”；二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中改”。,一、定位突变,基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。,（一）定位突变的设计目标及解决方法,定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系的研究等。,Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法：,热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质,引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替换表面荷电基团，His、Cys以及Tyr的置换专一性的改变，增加逆转数，改变酸碱度,（二）定位突变的种类,要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。根据基因突变的方式，分为以下三类：插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。,（三）定位突变的程序,1建立所研究蛋白质的结构模型,可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。,2找出对所要求的性质有重要影响的位置,在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。,3预测突变体的结构,根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较；利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。,4构建突变体，获得突变体蛋白,依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。,5突变体蛋白质的检验,测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等，并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果，同时进一步修正设计方案。,蛋白质中功能残基的鉴定,根据结构信息确定残基的突变,突变方法鉴定突变功能残基,利用蛋白质同源性鉴定功能残基,（四）蛋白质中功能残基的鉴定,1根据结构信息确定残基的突变,最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。,2突变方法鉴定突变功能残基,通过引进另外一种突变来检测随机突变技术删除分析及连接片段扫描突变,3利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基,高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关。非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。,（五）定位突变的应用,RNaseT1的结构改造是分于设计中的一个成功实例T1核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，热稳定性增加。,例：甲基对硫磷水解酶结构和功能的研究有机磷农药的长期广泛使用已经使很多水体及土壤被严重污染,而且直接影响到人们的身体健康。有机磷水解酶的改造：提高对特定底物的催化效率;扩大底物范围;增加酶的稳定性;DongYJ,2005,目的和意义通过对MPH的结晶和三维结构的测定，研究MPH活性中心的结构，并通过定点突变及活性测定来验证，确定MPH的结构和功能的关系,为MPH的改性和利用提供科学的依据和良好的材料。OPH是目前在各方面研究最为透彻的有机磷农药降解酶，同时也是应用最为广泛的农药降解酶，为此对甲基对硫磷水解酶的深入研究将有利于甲基对硫磷水解酶的广泛应用。,载体污染序列的分析在进行序列分析时，首先需确定序列是否含有载体序列的污染，如果含有载体序列，需截去后再进行其他分析。/VecScreen/VecScreen.html在线分析。,MatchtoVector:,Strong,Moderate,Weak,Segmentofsuspectorigin:,SegmentsmatchingvectorStrongmatch:1-113,3838-4071bp。真正的目标序列：1143,837bp。,1ThenucleotidesequenceincludingmpdfromPseudomonassp.WBC-32Plesiomonassp.M6的甲基对硫磷水解酶基因匹配区为1341866，Identities=1720bp1733bp(99)CDS:331aa(398-1393bp)3Pseudomonasputida的甲基对硫磷降解蛋白基因匹配区为1681393，Identities=10251026(99)CDS:341aa(368-1393bp)两个基因的CDS不一致，分别匹配于MPH的398，368-1393bp,同源序列搜索（Blastn:114-3837bp）,1,2,3,甲基对硫磷水解酶基因的分析,结论：MPH基因的CDS:3981393（331aa),以1393位的TGA结束的可能的ORF有八个,MW:34.4kDATG:368，398bp典型的启动子序列结构:TTGCAA-17个氨基酸-TATACT(320-365bp)典型的核糖体结合位点:AGGA(381bp),MPH与OPH的序列比对,二者同源性仅为13.6%，确定MPH是一个有别于OPH的蛋白质。二者在功能上的相似性不能用蛋白的一级序列的相似性加以解释，推测二者功能上的相似性与其一级序列构成的高级结构中活性中心结构的相似性有关。,MPH信号肽的分析预测：神经网算法,结论：信号肽（1-35氨基酸）。,C值表示切割点的可能性，S值表示具有信号肽的可能性,MPH信号肽的分析预测：马尔可夫算法,信号肽的一般结构为：正电荷的n-region；疏水的h-region；中性极性的c-region。,MPH具有典型的信号肽的三部分结构结论：可能的信号肽为1-35氨基酸。,ml,mAU,MPH的凝胶过滤柱层析图,MPH的SDS-PAGE分析,MPH中金属种类及含量的测定MPH的浓度：0.217mg/ml,结论：MPH中含锌离子,硒代蛋氨酸MPH的表达纯化在诱导表达时添加高浓度的与蛋氨酸有共同的合成途径的终产物赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸，以及与赖氨酸具有相互协同作用的苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸来抑制正常菌株中蛋氨酸的合成，迫使细菌利用培养基中外源添加的硒代蛋氨酸，合成硒代蛋氨酸MPH。由于硒代蛋氨酸不稳定而易发生氧化，因此在纯化时需要加快速度，并在缓冲液中添加还原剂以保持还原性环境，如5mM-巯基乙醇。,甲基对硫磷水解酶（MPH）P1晶型的晶体,甲基对硫磷水解酶（MPH）P43212晶型的晶体,硒代蛋氨酸MPH的晶体,同源二聚体每个亚基含有一个由两个二价金属离子组成的中心。Ala36为MPH的N末端第一个氨基酸（不具有1-35个氨基酸序列的结构）。,甲基对硫磷水解酶（MPH）三维结构图,a,b,a:ThebinuclearmetalcenteroftheOPH;b:ThebinuclearmetalcenteroftheMPH;,MPH与OPH双核金属中心结构比较,a:ThesupposedleavinggroupsubsiteoftheMPH;b:TheleavinggroupsubsiteoftheOPH;,a,b,MPH与OPH双核金属中心附近氨基酸比较,推测：Trp179，Phe196，Phe119是MPH底物结合部位的氨基酸,甲基对硫磷水解酶中三个芳香族氨基酸的功能研究,在MPH三维结构基础上可以看出Trp179，Phe196，Phe119的芳香侧链伸向MPH双核金属中心的上方，处于活性中心的入口处，推测为底物结合部位的氨基酸。通过定点突变将以上三个不同位点突变成含有芳香环的类似氨基酸及不具芳香环侧链很小的丙氨酸，从而获得了针对Trp179，Phe196和Phe119三个位点的六个突变体W179F、W179A、F196W、F196A、F119W和F119A，系统比较了突变体与野生酶的催化动力学特点，以确定三种氨基酸在MPH的结构和功能中的作用。,mpd基因表达载体的构建,W179F，W179A，F196W和F196A突变体基因的扩增,MPH及其突变体的表达菌株诱导表达产物的SDS-PAGE分析,E.coliBL21(DE3)/pET5a-mpd表达产物的SDS-PAGE分析,MPH及其突变体的比活力及动力学参数,实验小结利用生物信息学手段对MPH的结构基因的编码序列进行分析，确定MPH是一种结构未知的蛋白质，并在对其性质进行分析预测的基础上，通过对MPH的纯化、结晶获得P1晶型和P43212晶型两种单晶以及硒标记MPH的晶体。通过合作利用P43212晶型的晶体解析了MPH的三维结构证实了MPH与OPH功能上的相似性可能与两种蛋白三维结构的相似性有关的推测。同时，在MPH三维结构的基础上，推测并通过定点突变及活性测定验证了Trp179和Phe196属于MPH活性中心的底物结合部位关键氨基酸，Phe119在与底物结合中的作用不明显。以上对于MPH的结构和功能的关系的研究为MPH的改性和利用提供科学的依据。,二、蛋白质分子拼接,例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域之间由柔韧性较大的“铰链”片段相连。研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征有利于它的细胞识别和粘合作用。,英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分子上作了实验(人源化抗体),单链抗体scFv结构,抗DON单链抗体改体研究,DON:小麦镰刀菌毒素,单链抗体的linker改造,GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGSGGGGGGGSGGG,VH,VH,VH,VH,VH,VH,VL,VL,VL,VL,VL,VL,单链抗体的改体模型,VH,VH,VH,VH,VH,VH,Linker12aa,V,V,V,V,V,V,Linker,Linker,3-12aa,3aa,V,V,V,V,VH,VH,VH,VH,Linker,Xho,SalI,Sal,SalXho双酶切,EcoRIXho双酶切,EcoRISalI双酶切,differentlength,连接,技术路线,EcoRI,亲和力初步测定,PCR扩增重链、轻链策略,Linker,VH,VL,P3,P4,P5,P6,P7,P8,P1,P2,PCR反应体系及反应条件,50L反应体系如下：10TaqPCRBuffer5LdNTP(2.5mM)3LForwardPrimer(20mM)1LReversePrimer(20mM)1LTemple1LrTaq0.3L,AddddH2Otoafinalvolumeof50L,PCR循环条件为：945min，1个循环；9445s，5830s，7245s，31个循环；7240s，25个循环；727min，1个循环。取PCR产物5L，1.0的琼脂糖电泳检测。,VH和VL的PCR扩增结果,7500,15000,10000,2500,100,250,500,750,1000,2000,1000,250,5000,菌落PCR重组子验证,123456712345671234567,2000,1000,750,500,250,100,2000,2000,1000,1000,750,750,500,500,250,250,100,改体抗体在大肠杆菌BL21中的表达及其纯化,12345678,97.4KD,66.2KD,42.7KD,31KD,改体抗体的ELISA初步测定,3,1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,单链抗体抗体：是体液免疫应答的主要效应分子。由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链）组成。,双特异性单链抗体的构建与表达,单链抗体（scFv）：抗体可变区的重链（VH）与轻链（VL）通过一段约15-25个氨基酸残基构成的弹性短肽（Linker）相连，融合表达出来的抗体片断。,双特异性单链抗体能识别两种抗原并能与之结合的单链抗体（或抗体复合物）称为双特异性单链抗体。本实验将能够各自产生抗DON毒素和抗ZEN毒素的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时与DON和ZEN两种毒素抗原特异性结合的双特异性单链抗体。,玉米赤霉烯酮(ZEN),技术路线,DON和ZEN抗体基因的提取目的基因片段引物的设计PCR扩增目的片段制备感受态细胞酶切目的片段、载体，linker连接转化连接产物酶切验证重组子表达、纯化蛋白,载体的构建,Anti-ZENgene,Anti-DONgene,XhoEcoRSalNco,连接,Linker,PCR扩增Anti-DON基因,12M,20001000,(bp),800bp,750,250100,500,PCR扩增Anti-ZEN基因,M12,20001000,750,500250,100,(bp),750bp,重组验证,PCR验证,以重组质粒为模板，进行Anti-DON基因的PCR分析。,双特异性抗体的表达,我们知道,蛋白质的空间结构受其氨基酸序列控制,而功能又与结构密切相关。如果能够找到构造蛋白质结构的方法,我们就能得到具有任意结构和功能的全新蛋白质,这就是蛋白质全新设计问题。,第三节全新蛋白质设计,蛋白质从头设计概念,从头设计能够根据生物分子的活性位点特征产生一系列的结构片段，通过连接这些结构片段可以构成一个全新分子；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。从头设计方法可以生成全新的分子结构。,全新蛋白质设计包括,一、全新蛋白质设计方法二、蛋白质结构的从头设计,全新蛋白质设计过程,（一）全新蛋白质设计程序,一、全新蛋白质设计方法,（二）全新蛋白质设计目标的选择,依据设计的目的可以分为：从头结构设计从头功能设计,从头结构设计,中心问题：稳定及独特的三维结构序列；基本障碍：线性聚合构象熵；解决方法：（1）使相互作用的强度与数目达到最大；（2）共价交叉连接。,从头设计方法包含的步骤,1、活性位点分析：对结合位点的具体的化学信息进行扫描、分析和归类。这些信息的三维空间相互关系都必须充分考虑。2、配体分子构建：采用不同的片段选择和分子构建方法，产生相应的分子结构。3、评价：使用特定的评分系统将构建的分子与活性位点的匹配性进行排序，可以选择其中优良的结果作为合成实验的对象。也可以将之做新一轮计算的起点进行进一步的优化。,二、蛋白质结构的从头设计,（一）蛋白质结构的从头设计原则1二级结构的设计原则螺旋折叠片转角2超二级结构和三级结构的设计原则,螺旋,(PHPPH)(Leu、Glu、Met),C端：aa+N端：aa-,折叠片,(HPHPH或PHPHP，5-10aa),转角（Pro、Gly中断螺旋，Glu中断折叠）,蛋白质的几种超二级结构、-、-,从头设计的三股式折叠,