PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测.ppt

阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测,李智伟,PNH(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria),是一种罕见的获得性克隆造血干细胞疾病。但近年来有增多趋势。我国北方多于南方。半数以上发生在20-40岁青壮年。男性多于女性，与遗传及种族无关。本病起病隐袭缓慢，呈慢性过程，以贫血、出血为首发症状者较多，以血红蛋白尿起病者较少。,血红蛋白尿,睡眠有关，早晨较重，下午较轻尿液外观为酱油或红葡萄酒样;伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、发热等,原因,因为补体作用最适宜的pH是6.87.O，而睡眠时呼吸中枢敏感性降低，酸性代谢产物积聚,研究历史,Strubing第一次报道PNHHam和Dingle证明了PNH患者的红细胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就是现在普遍使用的Ham实验1983年证实PNH患者GPI合成异常1993年pig-a基因突变,流式细胞术,原理：X染色体上PIG-A（造血干细胞经获得性体细胞基因）突变导致糖化肌醇磷脂(GPI)锚合成障碍导致由GPI锚接在细胞膜上的一组膜蛋白丢失，包括CD16、CD55、CD59等,GPI锚连接蛋白,补体调接蛋白衰变加速因子(DAF或CD55)、膜攻击复合物抑制因子(MACIF或MIRL或CD59)、补体C8结合蛋白(HRF或C8bp)、膜辅助蛋白(MCP)。粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3或CD58)、Blast-1/CD48、CD67、CD66。,GPI锚连接蛋白,酶类红细胞乙酰胆碱脂酶(AchE)、中性粒细胞碱性磷酶酸酶(NAP)、5外核酸酶(CD73)。受体类中性粒细胞III型Fc受体(FcRIIIb或CD16)、单核细胞分化抗原(CD14)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(u-PAR)。血型抗原CD55携带的Comer抗原、AchE携带的Yt抗原。,1型细胞CD59完全阳性,补体激活途径,C1C1C2,C4C4b2b(C3转化酶）C3C3bP（备解素）PC3bBbC3bB(C5转化酶）C4b2b3b或PC3bBbC8C9C6C7C5C5bC5b678C5b-9(MAC),CD59,替代途径,经典途径,CD55,Ag-Ab,分析,1.红系及粒系FSC/SSC设门报告标本中CD55、CD59阴性比例,做2030份正常人血样划定阳性区（区）范围同型阴性对照界定区范围，中间的区域即为区。,根据CD59可以将PNH细胞分为3型1型细胞CD59完全阳性正常细胞2型细胞CD59部分阳性补体中度敏感细胞3型细胞CD59完全阴性补体敏感细胞,CD55和CD59同时部分或完全缺失是PNH的典型表现，单GPI缺失不能确诊。CD59重要性大于CD55单CD55缺乏时并不因此改变红细胞对补体的敏感性而造成溶血CD59的缺失会增加补体的敏感性临床上以CD59缺失作为诊断标准是一个趋势。解决了一切以补体溶血为基础的实验诊断方法在诊断PNH的不确定性,意义,其它细胞的PNH检测,PNH患者的红细胞、粒细胞、单核细胞及淋巴细胞上GPI锚连膜蛋白部分或全部丧失。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞骨髓PNH克隆出现比外周血早，网织红细胞略早于红细胞,其它细胞的PNH检测,应用FSC/SSC设门分析时会有许多脱颗粒的中性粒细胞，这时只使用物理特征无法准确设定粒细胞门了，这时必须使用系列标志/SSC设门:CD15，CD33。CD64设门，分析单核CD14,CD55,CD59，PNH病人检测GPI缺乏的血小板不容易分辨不能只根据淋巴细胞上GPI相关蛋白的表达来诊断。,与其他实验比较,1.酸溶血试验(Ham试验)患者红细胞与含5%盐酸的正常同型血清混合，pH6.4，37孵育2小时，溶血明显。本试验特异性高，敏感性差。2.蛇毒因子溶血试验蛇毒因子能通过补体交替途径，使补体敏感的红细胞发生溶血。本试验特异性强，敏感性优于酸溶血试验。3.热溶血试验和蔗糖溶血试验因特异性差，常作为筛选方法。,具有PNH克隆的血液病,检测粒细胞GPI锚连蛋白表达病种检测例数缺失例数(%)AA11525(22%)MDS399(23%)并发现MDS有PNH表达者ATG（人胸腺细胞免疫球蛋白）治疗有效(AnInternMed1999，131:401),PNH和AA关系,相当密切，可以相互转化且并存AAPNH较多(15%)，PNHAA少20%30%PNH可伴骨髓再障AA(ATG治疗后)PNH1031%AA-PNH综合征16.5%(我国)50%AA外周血或骨髓可检出PNH克隆AAPNH生存率要高于PNHAAMDS-RA如捡出PNH克隆者预后好，且ATG(人胸腺细胞免疫球蛋白)治疗有效。PNH对AA和MDS的“自然治疗”，而“AA救了PNH”。,PNH克隆见于淋巴增殖性疾病,检测病种例数NHL87HD55红细胞CD55/CD59CLL49缺失检出率9.2%ALL22HCL4(HematolJ2001，2:33),PNH克隆见于浆细胞病,检测红细胞CD55/CD59缺失病种检测例数缺失例数(%)MM626WM72MGUS61HCD21合计7710(12.9%)(IntJHematol2002,75:40),FLAER,嗜水气单胞菌溶素变异体(FLAER)。1998年Diep等报道嗜水气单胞菌(HEC)毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合，随后立即聚合成多具体，插入细胞膜脂质双层，在膜上形成孔洞致溶破。PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细胞完好。,FLAER,FLAER在所有具有GPI锚连蛋白的白细胞上都有特异性表达，所以正常人及非PNH贫血FLAER成100%阳性。是目前诊断PNH最敏感、特异的方法。FLAER对PNH克隆检出的敏感性为0.1%，其它靶向标记检出率的敏感性为1%；,结果分析,1.设门CD45/SSC2.标记CD15，CD14，CD45，FLAER检测PNH粒、单核及淋巴细胞，报告标本中各系细胞FLAER阴性比例,FLAER,目前FLAER一般用于有核细胞的检测，不能评价红细胞的PNH克隆。由于红细胞表面没有气单胞菌溶素前体产生所需要的蛋白水解酶类，尽管表达在红细胞表面的血型糖蛋白不是锚连蛋白