第六章 黄酮类化合物

第五章黄酮类化合物,Flavonoids,概述,黄酮类化合物多具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。基本结构：以前，黄酮类化合物(flavonoids)主要是指基本母核2-苯基色原酮(2-phenyl-chromone)类化合物，现在则是泛指两个苯环（A-与B-环）通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物，一般具有C6-C3-C6的基本骨架特征。,概述,生物合成,黄酮的基本骨架是由三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的。A环来自于三个丙二酰辅酶A，而B环则来自于桂皮酰辅酶A。,第一节结构分类,根据中央三碳链的氧化程度、B-环联接位置(2-或3-位)以及三碳链是否构成环状等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分类。,（一）黄酮类,（一）黄酮类,以2-苯基色原酮为基本母核，3位无含氧取代A环5,7位几乎同时带有羟基，而B环4位常有羟基或甲氧基，3位有时亦有。,黄芩苷,（二）黄酮醇类,黄酮基本母核3位含有羟基或其他含氧基团。,槲皮素R=H芦丁R=芸香糖,（三）二氢黄酮类,黄酮基本母核2，3位双键被氢化。,（四）二氢黄酮醇类,黄酮醇的2，3位双键被氢化，常与黄酮醇共存于同一植物。,（五）异黄酮类,母核为3-苯基色原酮；B环连接在C环的C-3位。,（六）二氢异黄酮类,异黄酮的2，3位双键被氢化,（七）查耳酮,二氢黄酮C环的1，2位键断裂生成开环衍生物，即三碳链不构成环。,红花苷,（八）二氢查耳酮,查耳酮，双键氢化。,（九）橙酮类,C环为含氧的五元环。,（十）花色素类,C环无羰基，1位氧原子以烊盐形式存在。,（十一）黄烷醇类,C环的3位或4位存在羟基，常分为黄烷3醇（儿茶素）和黄烷3,4二醇（无色花色素类）。,（十二）shan酮类,苯并色原酮，母核由两个苯环与色原酮的2,3位骈合而成。,（十三）双黄酮类,两分子黄酮、两分子二氢黄酮或一分子黄酮与一分子二氢黄酮以C-C或C-O-C键连接而成。,存在形式,多以苷存在：O-苷和C-苷糖的种类：单糖：D-葡萄糖，D-半乳糖，D-木糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-葡萄糖醛酸双糖：槐糖，龙胆二糖，芸香糖（Rha16Glc），新橙皮糖（Rha12Glc）等三糖：龙胆三糖，槐三糖酰化糖：2-乙酰葡萄糖，咖啡酰基葡萄糖,常见取代基OH，OCH3，CH3，异戊烯基，甲二氧基,取代位置,OH，OCH3等含氧基团：A环：5，7位B环：3，4位,非含氧基团：A环：6，8位B环：2，3位,第二节理化性质与检识,一、性状，色泽性状：多为结晶，少数为无定形粉末。颜色：交叉共轭系统及羟基、甲氧基等助色团黄酮（醇）及其苷类呈灰黄-黄色查耳酮：黄-橙色二氢黄酮（醇）：无色异黄酮：微黄色花色素及花色苷：红色（pH8.5),二、溶解度,游离苷元：难溶于水，易溶于甲醇，乙醇，乙酸乙酯，乙醚等有机溶剂中苷：溶于水、乙醇、甲醇中，难溶于苯、氯仿水溶度：羟基越多，水溶性大；苷元7-羟基苷。,黄酮（醇），查耳酮二氢黄酮（醇）花色素,平面型分子非平面型分子离子,水溶性,水溶性：花色素二氢黄酮（醇）异黄酮黄酮（醇）、查耳酮,三、酸碱性,（1）酸性多具有酚羟基，故显酸性，酚羟基数目不同及位置不同，酸性强弱也不同。7，4-二羟基7-或4-OH一般酚OH5-OH碳酸钠碳酸氢钠氢氧化钠,（2）碱性吡喃环上的1-氧原子，因有未共用的电子对，故表现微弱的碱性。可与强酸成不稳定的盐。,三、酸碱性,四、显色反应,（一）还原显色反应,颜色反应多与分子中的酚羟及-吡喃酮环有关。,1.盐酸-镁粉（或锌粉）反应为鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应。黄酮（醇）、二氢黄酮（醇）显橙红-紫红色，少数显紫-蓝色。查耳酮、橙酮、儿查素：阴性；异黄酮：个别阳性、大多显阴性；花色素、部分橙酮、查耳酮在浓盐酸作用下显色，需做对照,2.硼氢化钠（钾）反应为鉴定二氢黄酮（醇）类化合物专属颜色反应（红色-紫红色）。,（二）金属盐类螯合反应,1.三氯化铝显色反应显黄色并有荧光；4羟基或7,4羟基黄酮醇显天蓝色荧光。,5-羟基、4羰基,3-羟基、4羰基,邻二酚羟基,2.锆盐-枸橼酸显色反应鉴别3-羟基或5-羟基黄酮类化合物。络合稳定性：3-羟基、4-酮基5-羟基、4-酮基，加枸橼酸，5-OH黄酮褪色，3-OH黄酮仍呈鲜黄色,3.乙酸镁显色反应常用醋酸镁钾溶液为显色剂，二氢黄酮(醇)类可显天蓝色荧光，黄酮(醇)及异黄酮类等则显黄-橙黄-褐色。,4.氯化锶显色反应在氨性甲醇溶液中，可与分子中具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物生成绿色-棕色乃至黑色沉淀。,（三）硼酸显色反应,鉴别5-OH黄酮或2-羟基查耳酮类结构（亮黄色）。,（四）与碱性试剂显色反应,1、二氢黄酮类（橙-黄色）,2、黄酮醇类在碱性中先呈黄色，通入空气后变为棕色，据此可与其它黄酮类区别。,3、黄酮有邻二酚羟基或3，4-二羟基，易被氧化，由黄色深红色绿棕色沉淀。,五、层析法,1、纸层析,苷元：分配层析。流动相：BAW系统（正丁醇-乙酸-水，4:1:5，上层）苷：双向纸层析。第一向：醇性溶剂展开，如BAW系统，化合物极性大，吸附强。第二向：水类溶剂展开，如：2-6%醋酸水，化合物极性大，吸附弱。,一次,二次,双糖苷单糖苷苷元,苷元单糖苷双糖苷,2、薄层层析（TLC）,主要指吸附薄层，常用硅胶TLC，聚酰胺TLC。硅胶TLC：鉴定弱极性化合物。展开剂：分离苷元：甲苯-甲酸甲酯-甲酸（5:4:1）分离苷：乙酸乙酯：-丁酮-甲酸-水（5:3:1:1）聚酰胺TLC：分离大多数黄酮及苷类（有游离酚羟基）,第三节黄酮类化合物的提取与分离,一、提取,粗提物的制备苷元可选乙醚、氯仿乙酸乙酯等中强极性的溶剂；苷可选用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水。,2.溶剂萃取法利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化目的。例如植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。而某些药料水溶液则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。,3.碱提取酸沉淀法黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再于碱水提取液中加入酸，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷的提取都应用了这个方法。,兹以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。槐米（槐树SophorajaponicaL.花蕾）加约6倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至pH8-9，在此pH条件下微沸20-30分钟，趁热抽滤，残渣同上再加4倍水煎1次，趁热抽滤。合并滤液在60-70下，用浓盐酸调至pH为5，搅匀，静置24小时，抽滤。沉淀物水洗至中性，60干燥得芦丁粗品，于水中重结晶，70-80干燥得芦丁纯品。,在用碱酸法进行提取纯化时，应当注意所用碱液浓度不宜过高，以免在强碱性下，尤其加热破坏黄酮母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成yang盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。当药料中含有大量果胶、粘液等不溶性杂质时，如花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其它碱性水溶液进行提取，以使上述含羟基的杂质生成钙盐沉淀，不致溶出。这也有利于黄酮类化合物的纯化处理。,注意事项,二、分离,依据：极性不同-硅胶、氧化铝（极性吸附）酚羟基数目、位置不同-聚酰胺（氢键）酸性不同-PH梯度分子量不同-凝胶柱层析特殊结构-化学方法,硅胶柱层析：此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。吸附规律：极性大吸附牢。如：A苷元B单糖苷C二糖苷Rf:ABC,2.聚酰胺柱层析：其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。洗脱剂：水乙醇甲醇丙酮氢氧化钠水溶液（氨水）甲酰胺CBA硅胶：ABCDE,3.葡聚糖疑胶(Sephadexgel)柱层析：对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：Sephadex-G型及SephadexLH-20型。SephadexG适用于水系统SephadexLH-20适用于水及有机溶剂系统,葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机理是：分离游离黄酮时，主要靠吸附作用。凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。分离黄酮苷时，则分子筛的属性起主导作用。在洗脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体，葡聚糖凝胶柱层析中常用的洗脱剂有：(1)碱性水溶液（如0.1mol/LNH4OH），含盐水溶液(0.5mol/LNaCl等)。(2)醇及含水醇，如甲醇，甲醇-水（不同比例）、正-丁醇-甲醇(3:1)、乙醇等。(3)其它溶剂：如含水丙酮、甲醇-氯仿等。,4.梯度pH萃取法,分离酸性强弱不同的黄酮苷元酸性：7,4-OH7-或4-OH一般OH5-OH,溶于NaHCO3Na2CO3不同浓度的NaOH,样品,乙醚,乙醚液,依次萃取,5%NaHCO35%Na2CO30.2%NaOH4%NaOH,分别酸化,各部分黄酮,酸性减弱,习题：从某植物中分离出四种化合物，其结构如下：,试比较四种化合物的酸性，极性大小比较它们的Rf值大小顺序：1）硅胶TLC，展开剂CHCl3-MeOH（9:2）2）聚酰胺TLC，60%MeOH/H2O3）纸色谱，15%醋酸-水,AR1=R2=H3,7,4-OHBR1=H,R2=Rha3,4-OH,7-RhaCR1=Glc,R2=H7,4-OH,3-GlcDR1=Glc,R2=Rha4-OH,3-Glc7-Rha,酸性ACBD极性DCBARf：ABCDDBCADCBA,分离实例1,分离实例2,第四节黄酮类化合物的结构鉴定,一、紫外光谱法在黄酮类鉴定中的应用,原理：黄酮类存在桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭系统，在200400nm间，有两个主要的紫外吸收带。,峰带II，220280nmA环苯甲酰基系统,峰带I，300400nmB环桂皮酰基系统,共性：B环OH增加，峰带I向长波位移，波长增大，特别是4-OH，红移大；A环OH增加，峰带II波长增大。,1.黄酮、黄酮醇类峰带I和II强度相似,nm,I,II,带I：黄酮类304350nm黄酮醇（3-OH被取代）328357黄酮醇（3-OH游离）352385带II：240285nm,(一)黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱判断黄酮类化合物类型,2.查耳酮、橙酮类带I强，带II次强峰,nm,I,II,查耳酮带I340390nm(有裂分)带II220270nm,橙酮370430nm(34个峰),3.异黄酮、二氢黄酮(醇)类带I弱，带II强峰,I,II,只有A-环苯甲酰系统，带II为主峰带II异黄酮245270nm二氢黄酮（醇）270295nm带I肩峰,（二）利用诊断试剂，判断羟基位置,1.甲醇钠（NaOMe）-黄酮类化合物上所有酚羟基，均可在NaOMe中成盐，引起红移。a.4-OH,带I位移4060nm,强度不降.b.3-OH,但无4-OH,带I红移5060nm,强度下降.d.3,4-OH,3,3,4-OH,3,4,5-OH等,随时间延长,峰衰退.,确定4-OH,2.醋酸钠（NaOAc）-NaOAc碱性较NaOMe弱，只能使7-OH，4-OH解离。由于未熔融的NaOAc中含微量HOAc，限制4-OH的解离。7-OH，带II红移520nm。4-OHband红移4060nm,强度不降有5,6,7-三OH，6,7,8-三OH或3,3,4-三OH时，峰随时间衰退。,确定7,4-OH,3.NaOAc/H3BO3邻二酚羟基在NaOAc碱性下，可与H3BO3螯合，引起红移。黄酮（醇）：B环具邻二酚羟基，带I红移1230nm；A环具邻二酚羟基(除5,6-二OH)，带II红移510nm。异黄酮，二氢黄酮（醇）：A环具邻二酚羟基(除5,6-二OH)，带II红移1015nm。,确定邻二OH,4.AlCl3及AlCl3/HClAlCl3与5-OH,4-C=O,3-OH,4-C=O及邻二酚OH络合，引起红移。规律：(1)生成铝络合物的稳定性顺序：3-OH(黄酮醇)5-OH(黄酮)5-OH(二氢黄酮)邻二酚OH3-OH(二氢黄酮醇)(2)邻二酚OH和二氢黄酮醇的3-OH形成的络合物遇酸分解。(3)当3-OH与5-OH共存时，优先生成3-OH-4-酮基络合物。(4)3-OH或5-OH及邻二酚OH同时存在，形成二络合物。,a.AlCl3/HCl与MeOH中光谱比较相同时，示无3-OH或5-OH。不同时，只有5-OH，无3-OH时，带I红移3355nm；同时有5-OH，3-OH时，带I红移5060nm；只有3-OH时，带I红移60nm。b.AlCl3/HCl与AlCl3中光谱比较相同时，无邻二酚羟基；不同时，B环有邻二酚羟基，带I紫移3040nm；A,B环同时有邻二酚羟基，带I紫移5060nm。,邻二OH,3-OH,5-OH,黄酮（醇）：,二、黄酮类化合物的NMR波谱特征（一）黄酮类化合物1H-NMR谱(DMSO-d6)特征DimethylSulfoxide,5OH：12ppm7OH：11ppm3OH：10ppm,A环上的芳氢：6H：5.7-6.9(d,J=2.5)8H：5.7-6.9(d,J=2.5),黄酮类化合物1H-NMR谱黄酮醇,A环上的芳氢：5-H：7.98.2（d,J=9.0）6-H：6.77.1（dd,J=9.0,2.5）8-H：6.77.0（d,J=2.5）,黄酮类化合物1H-NMR谱二氢黄酮醇,A环上的芳氢：5-H：7.77.9（d,J=9.0）6-H：6.46.5（dd,J=9.0,2.5）8-H：6.36.4（d,J=2.5）,黄酮类化合物1H-NMR谱,B环上的芳氢（H-3,5较为高场）：H-3,5：6.57.1（d,J8.5）H-2,6：6.57.9（d,J8.5）,黄酮类化合物1H-NMR谱,B环上的芳氢：H-5：6.77.1（d,J8.5）H-2：7.27.9（d,J2.5）H-6：7.27.9（dd,J8.5,2.5）,黄酮类化合物1H-NMR谱,C环上的氢：,H-2（异黄酮）:7.67.8(1H,s);8.58.7(1H,s,DMSO-d6),黄酮类化合物1H-NMR谱,C环上的氢（二氢黄酮）：,H-2:5.22(1H,dd,J=11.5,5.0)H-3:2.80(1H,dd,J=17.0,11.5)(1H,dd,J=17.0,5.0),化合物H-2H-3二氢黄酮醇4.80-5.00d(11.0)4.10-4.30d(11.0)二氢黄酮醇3-O-糖苷5.00-5.60d(11.0)4.30-4.60d(11.0),黄酮类化合物1H-NMR谱,C环上的氢（二氢黄酮醇）：,黄酮类化合物1H-NMR谱,C环上的氢（查耳酮）：,H-：6.50-6.70(1H,d,J=Ca.17.0)H-：7.30-7.70(1H,d,J=Ca.17.0),黄酮类化合物1H-NMR谱,C环上的氢（橙酮）：,苄氢:6.50-6.70(1H,s)6.37-6.94(1H,s,DMSO-d6),黄酮类化合物1H-NMR谱,化合物糖上的H-1黄酮醇3-O-葡萄糖苷5.70-6.00黄酮醇7-O-葡萄糖苷4.80-5.20黄酮醇4-O-葡萄糖苷黄酮醇5-O-葡萄糖苷黄酮醇6及8-C-糖苷黄酮醇3-O-鼠李糖苷5.00-5.10二氢黄酮醇3-O-葡萄糖苷4.10-4.30二氢黄酮醇3-O-鼠李糖苷4.00-4.20,糖上的氢,苯环上其他取代基的氢：,取代基甲基2.04-2.45(3H,s)乙酰氧基2.30-2.45(3H,s)甲氧基3.45-4.10(3H,s