第六讲-DNA的提取原理及提取技术

,DNA的提取原理及提取技术,天然DNA的来源：,1染色体DNA原核生物和真核生物均含有染色体DNA,它是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料。2病毒和噬菌体DNA主要用于构建基因克隆载体，也可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料。,3质粒DNA很多微生物（大肠杆菌、农杆菌和蓝细菌）都含有质粒DNA，主要用于构建基因克隆载体，也可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料。4线粒体和叶绿体DNA这是真核生物特有的染色体外遗传物质，分别含有与呼吸作用和光和作用相关的基因。主要用于分离目的基因。,植物细胞的化学成分主要有:,1水、糖类、蛋白质、脂肪以及核酸是生物体所需的基本成分；2氨基酸是合成蛋白质的基本原料；3果胶、纤维素、半纤维素是植物细胞壁的组成成分；4淀粉是光合作用的产物；5金属离子主要用来调节细胞的渗透平衡等，比如钾和钠，镁和锰是叶绿素的成分。,植物总DNA提取原则,保证DNA结构的完整性排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染,植物DNA提取的基本原理,DNA特点：DNA是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNP在盐溶液中的溶解度随着盐浓度的增加而增加。,植物DNA提取的基本原理,DNA提取基本步骤：1细胞裂解和DNA的溶解主要任务：破碎细胞并对DNA实施保护。采取措施：利用液氮研磨，使酶失活；快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中DNA进行保护。,EDTA螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+,使DNA酶活性降低；SDS使蛋白质变性并降解蛋白质，也可降低DNA酶的活性；抗氧化剂降低酚类氧化对DNA的干扰；PVP与多酚形成复杂的聚合体，与多糖结合，有效去除多糖；。,植物DNA提取的基本原理,2与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除；主要利用DNA与蛋白质、多糖等在生化性质上的差别，通过加入离子变性剂，去污剂使蛋白质或多糖变性，核蛋白解聚。CTAB十六烷基三甲基溴化铵SDS十二烷基磺酸钠,除蛋白质,氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤(当溶液中的中性盐的浓度大于1mol/L时，蛋白质会沉淀析出.)蛋白酶处理,除多糖,高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。,除酚类物质,在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,除各种离子70的乙醇洗涤注意：我们在提取某种植物DNA时，需要考虑以上各种杂质的存在，根据某种植物DNA的具体情况采取相应的去除杂质的方法。,植物DNA提取的基本原理,3DNA的沉淀和纯化沉淀：无水乙醇TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA.pH8.0）作用：TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasePH值为8.0，可防止DNA发生酸解,DNA的纯化技术,琼脂糖凝胶电泳洗脱法主要用于小剂量DNA的纯化和酶切片段的回收。1DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带后，切取含有待纯化DNA带的琼脂糖凝胶电泳块，装入透析袋中；2透析袋中加入适量经稀释的电泳缓冲液，并置于稀释的电泳缓冲液中电泳1-2h，使DNA脱离琼脂糖凝胶；,DNA的纯化技术,琼脂糖凝胶电泳洗脱法3再反向电泳30s-1min，使附着在透析袋膜上的DNA重新进入缓冲液中；4吸取透析袋中的洗脱液置于离心管中，以10000r/min离心5min,转移上清液到另一个离心管中，加入3MNaAc，再加入2体积无水乙醇，-20放置1.5min以上；,DNA的纯化技术,琼脂糖凝胶电泳洗脱法54，12000r/min离心20min，弃上清，沉淀在空气中晾干，溶于TE中，-20保存备用。,DNA提取技术,一、染色体DNA的提取CTAB法（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵）SDS法（十二烷基磺酸钠，Sodiumdodecylsulfate,简称SDS）,二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法,CTAB法（植物DNA提取经典方法）,原理：CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。,该复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时从溶液中沉淀。通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。,CTAB提取缓冲液的配方,Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；Tris(三羟甲基氨基甲烷)EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB法提取植物DNA的操作步骤,1称取25g新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1cm长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后，加入15mL预热（6065）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65水浴保温0.51h，不时地轻轻摇动混匀。,CTAB法提取植物DNA的操作步骤,加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下4000r/min离心5min，静置，离心管中出现3层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。,CTAB法提取植物DNA的操作步骤,根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。收集上层清液，并将其倒入离心管中。慢慢加入12倍体积预冷的70%乙醇。可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）。离心，即得到DNA粗制品。,CTAB法提取植物DNA的操作步骤,6上述DNA粗制品含有一定量的RNA和其它杂质。若要制取较纯的DNA，可将粗制品溶于TE缓冲液中，加入10mg/mL的RNase溶液，使其终浓度达50g/mL，混合物于37水浴中保温30min除去RNA。,CTAB法提取植物DNA的操作步骤,770乙醇沉淀DNA。最后，将DNA溶于250L的TE缓冲液中。,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？,（1）整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）；这样可防止和抑制内源DNase对DNA的降解；（2）当DNA处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管，尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。,质粒DNA的提取碱裂解法,质粒DNA的提取碱裂解法,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,原理：在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。,溶液I（50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mMTris-HClpH8.0）作用：分散细胞溶液II(0.2mol/LNaOH,1%SDS)(SDS,十二烷基硫酸钠）作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III（3mol/LKAc,PH4.6）作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白、线性DNA沉淀。,提取大肠杆菌质粒DNA的步骤,1取制备好的菌液1.5ml通过离心沉淀得到的菌体悬浮于100ul预冷的溶液中，震荡使细胞分散。2在冰水浴中5min后，加入200ul溶液，快速颠倒几次，使充分混匀。此时，混合液的PH值在12.6，使细胞壁破裂，DNA变性。,3DNA的分离抽提。将离心管置于冰水浴中5min后，加入150mL预冷的溶液，颠倒离心管和震荡10s，使其混匀。置于冰水浴中5min。此时的PH值在7.0,使质粒DNA选择性复性，而染色体DNA随SDS和蛋