紫外可见分光光度计

第三章紫外可见分光光度法,第一节紫外可见分光光度法的基本原理第二节紫外可见分光光度计的基本结构第三节紫外可见分光光度法的应用第四节操作方法及注意事项第五节仪器的安装要求和养护保养第六节显色与操作条件的选择,第一节紫外可见分光光度法的基本原理,一、概述二、吸收光谱三、朗伯-比耳定律四、常用术语五、紫外可见分光光度法在农业上的应用,一、概述,（一）分类,基于比较溶液颜色深浅来确定物质含量的方法为比色分析法,目视比色法,光电比色法,分光光度法,可见分光光度法,紫外分光光度法,（二）紫外可见分光光度法的特点,1、灵敏度高测定最低浓度范围为10-510-6mol/L，相当于0.001%0.0001%,2、准确度高25%3、操作简便，分析速度快几分钟到数十秒4、应用广泛大多数无机离子和有机物,有一含铁量为0.0015%的纯碱4.000g，用0.05mol/L（1/6K2Cr2O7）的标准溶液滴定，需消耗多少毫升？,二、吸收光谱,（一）光的特性波动性和粒子性,560590,620760,590620,400450,450480,480500,500560,（二）光谱,所谓“谱”是指将某一事物按照一定的规律排列后形成的图表。光谱则是指：将不同波长的光按照它们波长大小的顺序依次排列，并且以波长为横坐标，以光强度为纵坐标所形成的图谱。,（三）物质的发射光谱和吸收光谱,（1）发射光谱当有外界能量供给物质时，物质的分子或原子可能吸收该能量而发射出具有其特殊形状的光谱，成为该物质的发射光谱。其中的光谱峰成为发射峰，所对应的波长称为发射波长最大的发射峰所对应的发射波长称为最大发射波长，记为max。,（2）吸收光谱,用不同波长的单色光依次照射待测物质，物质可能对某些波长的光产生比较强的吸收而使该波长的透射光减弱，透射光所形成的光谱成为该物质的吸收光谱。其中的光谱峰称为吸收峰，所对应的波长称为吸收波长，最大的吸收峰所对应的波长为最大吸收波长。,（3）光谱分析,在一定实验条件下，一定物质总是发射或吸收一定波长的光，并且其发射或吸收光的强度与该物质的含量存在相关关系。因此可以根据物质的发射或吸收光的波长来进行定性分析，而根据物质的发射或吸收光的强度来进行定量分析，这就是光谱分析。物质与光谱的严密的定性定量关系是光谱分析的理论依据。,（四）紫外可见光谱的波长范围,紫外可见分光光度法属于吸收光谱法。近紫外：200-400nm可见光400-760nm一般可概要地认为紫外到可见光的波长范围是200-800nm。,（五）物质对光的选择性吸收,溶液的颜色是基于物质对光有选择性吸收的结果。透明的溶液，是可见光都能透过，故无色。绿色溶液是吸收了紫色光蓝色溶液是吸收了黄色光两种单色光能够按照一定的比例混合为白光，称为互补色。,（六）吸收光谱曲线,1、吸收光谱曲线物质对不同波长光的吸收情况可以用吸收光谱曲线来描述。吸收光谱曲线是通过实验来获得的：将不同波长的光依次通过固定浓度的被测溶液，用分光光度计测量每一波长下相应对光的吸收程度（A，吸光度），以波长（）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标作图，得一曲线，为吸收光谱曲线，它描述了物质对不同波长光的吸收程度。现以邻菲罗啉亚铁吸收曲线说明之。,2、吸收曲线的讨论,同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似max不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同。,2、吸收曲线的讨论,吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。,2、吸收曲线的讨论,不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在max处吸光度A的差异最大。此特性可作作为物质定量分析的依据。在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,（七）吸收光谱曲线产生的机理,物质总是处在不断的运动中，而构成物质的分子或原子具有一定的运动方式，各种方式属于一定的能级，分子内部的运动方式有三种，既电子相对于原子核心的运动，原子在平衡位子附近的振动，分子本身绕其核心的转动。因此相应于这三种运动方式，分子具有电子能级、振动能级、转动能级。,能级跃迁,当分子从外界吸收能量之后，产生电子跃迁，即分子外层电子或价电子由基态跃迁至激发态。分子吸收的能量具有量子化的特征，即分子只吸收相当两能级差的能量。,能级跃迁,讨论,（1）转动能级间的能量差r：0.0050.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱,（2）振动能级的能量差v约为：0.05eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱,讨论,（3）电子能级的能量差e较大120eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外可见光区，紫外可见光谱或分子的电子光谱；,（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据；（5）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，是定量分析的依据。,三、郎伯-比耳定律,（一）郎伯定律当一束平行的单色光通过液层厚度为L的均匀、非散射的溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要减弱。A=K2L，K2系数,I0,It,L,（二）比耳定律,当厚度一定时，一束平行的单色光通过均匀、非散射的溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要减弱。溶液的浓度越大，光被吸收的越多。A=K1c，K1系数,I0,It1,I0,It2,（三）朗伯比耳定律,当用一束平行单色光照射均匀、非散射的稀溶液时，光的一部分被溶液吸收，另一部分透过溶液。物质对入射光的吸收强度与该物质的浓度及光在样品液中所经过的路程成正比，即A=EcLA为吸光度，E比例常数；L为光在样品液中所经过的路径（比色池的厚度，cm）；c溶液的浓度,吸光度和透光率的关系,（1）吸光度A与入射光I0及出射光It之间的关系定义为：A=logI0/It（2）透光率T=It/I0透射光强与入射光强值之比。（3）A=log1/TA（0），T（10）（100%0%）,（四）吸光系数的表示方法,1、吸光系数：浓度为1mg/L，液层厚度为1cm，在一定波长下测得的吸光度值。用K表示。例题：0.4009mg/L的表面活性剂十二烷基硫酸钠，在198nm下，用1cm比色池，在紫外分光光度计上测得的吸光度A=0.24，求吸光系数K。,K=0.5986（L/mgcm）,2、摩尔吸光系数,是指在一定波长时，物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时溶液的吸光度，用表示。实际中因为mol/L浓度过高，一般不直接测量摩尔吸光系数，而是用低浓度测定，然后再计算。例题：试液Fe2+含量为50ug/100mL，吸收池厚度为1cm，在波长510nm下，测得吸光度为A=0.099，计算摩尔吸光系数。（55.85）,=1.1104（L/molcm）,3、百分吸光系数或比吸光系数,指在一定波长时，物质的浓度为1%，液层厚度为1cm时，溶液吸光度，用E1%1cm表示。,（五）朗伯比耳定律的使用条件,1、稀溶液10-210-7mol/L2、单色光3、均匀溶液4、稳定溶液,（六）朗伯比耳定律的偏离,1、化学因素溶液不稳定，溶质发生解离、缔合以及与溶剂之间的作用等。,2、光学性质,（1）非单色光（2）杂散光（3）光的散射和反射（4）非平行光,四、常用术语,1、生色团：指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的基团。有机化合物中含有键的不饱和基团。能在紫外或可见区产生吸收，如：,2、助色团,有机化合物中引进一些含有孤对电子的氧、氮、硫、卤素等的基团，能使吸收波长向长波方向移动，并使吸收强度增加，这种基团称助色团。如NH2、OH、OR、SH、SR、Cl、Br、I等,3、红移、蓝移、增色、减色,物质的吸收波长向长波方向移动的现象称为红移，向短波方向移动的现象称为蓝移。使物质吸收强度增强、吸收系数增大的作用，称为增色；使物质吸收强度减弱、吸收系数减小的作用，称为减色。,4、共轭效应,当分子中含有单双键交替的共轭结构时，能形成一种所谓的大键，大键能使电子活动性增强，使*间的能级差变小，使*跃迁的吸收波长红移，同时吸收系数增大，共轭双键的这种作用称为共轭效应。,五、分子结构与吸收光谱,分子光谱是带状光谱分子的吸收光谱是由成千上万条彼此靠得很紧的谱线组成，看起来是一条连续的吸收带。,带状谱图,六、紫外可见分光光度法在农业上的应用,1、定量分析2、定性鉴别3、结构分析,作业,1、浓度为1.2810-4mol的KMnO4在1cm的吸收池中以525nm光波照射，透光率为50%，求：（1）该溶液的吸光度（2）若浓度加倍，求吸光度和透光率（3）若T=75%，求浓度2、朗伯比耳定律的使用条件3、名词解释：朗伯比耳定律、生色团、助色团、红移、蓝移、增色、共轭效应,第二节紫外可见分光光度计的基本结构,一、光源二、单色器三、吸收池四、检测器五、显示系统和数据处理系统,基本结构,光源,单色器,样品室,检测器,显示,一、光源,光源的作用是提供激发能,使待测分子产生吸收。要求能够提供足够强的连续光谱、有良好的稳定性、较长的使用寿命,且辐射能量随波长无明显变化。,光源分类,热辐射光源：利用固体灯丝材料高温放热产生的辐射作为光源的是热辐射光源如钨灯、卤钨灯。两者均在可见区使用,卤钨灯的使用寿命及发光效率高于钨灯。气体放电光源：在低压直流电条件下,氢或氘气放电所产生的连续辐射。,一般为氢灯或氘灯,在紫外区使用。这种光源虽然能提供至160nm的辐射,但石英窗口材料使短波辐射的透过受到限制(石英200nm,熔融石英185nm),而大于360nm时,氢的发射谱线叠加于连续光谱之上,不宜使用。,辐射光源的能量分布图,二、单色器,单色器的作用是使光源发出的光变成所需要的单色光。通常由入射狭缝、准直镜、色散元件、物镜和出射狭缝构成。是分光光度计的核心，决定整机性能的主要部件。,（一）入射狭缝和出射狭缝,狭缝由表面涂黑、相互间有一定间隙的两块金属薄片构成。其间隙为狭缝的宽度，狭缝的宽度可调。狭缝宽度愈小，透过光的单波长精度愈高，但宽度过小，则透过光强度弱、检测困难。入射狭缝是光进入单色器的入口，其作用是从光源中选出一束光，使其接近于平行光束进入单色器，并阻止其它光进入光路。出射狭缝是单色器的出口，其作用是从色散元件分散开的不同波长光中，仅让所需波长的光通过，而将其它波长的光挡住，使之不能射出单色器。,（二）准光镜（平面反射镜）与聚焦镜（球面反射镜）,聚光镜凹面反射镜构成。准光镜的作用是入射狭缝透过的光变为平行光照射到色散元件上。聚焦镜的作用是将色散元件分散开的不同波长的光分别聚在其焦平面上（即出射狭缝平面）的不同位置上，以便利于狭缝选出所需波长的光。,（三）色散元件,色散元件是单色器的核心。其作用是将复合光束按波长大小以不同的角度反射或透射出去，使不同波长的光互相分散，即“色散”，以便利于出射狭缝从中选出所需波长的光。色散元件常用棱镜和光栅。,棱镜,是利用不同波长的光在经过棱镜材料与空气界面时有不同的折射率的性质，使入射的复合光发生色散的元件。用于可见光时用玻璃制造，用于紫外光时用石英制造，用于红外光时用氯化钠晶体制造。,光栅,又称衍射光栅，是利用光的衍射及干涉现象使入射光发生色散的元件。光栅是在玻璃、石英或金属表面用金刚石刻划等间距的平行条痕而成。每毫米刻度内可刻划数十到数千条，因光谱区的不同而异。,比较,光栅与棱镜相比，光栅的色散率较大，且为线性。适用的波长范围也较宽。同时光栅质量也不断提高，成本不断下降。因此目前大多使用光栅为色散元件。色散率：色散元件将不同波长的光分散开的能力，称为色散力，色散力的大小用色散率来表示。,722型分光光度计单色器工作过程,三、吸收池（样品池、样品室）,用于盛放试液。石英池用于紫外-可见区的测量，玻璃池只用于可见区。样品池的厚度常用的有0.5cm、1.0cm、2.0cm等，以1.0cm最常用。样品池在使用前后应彻底清洗、凉干。样品池一般俗称比色皿。,四、检测器,简易分光光度计上使用光电池或光电管作为检测器。目前最常见的检测器是光电倍增管，有的用二极管阵列作为检测器。灵敏度为：光电倍增管光电管光电池光电倍增管是目前最常用的检测器。二极管阵列检测器是目前灵敏度最高的检测器,五、记录仪,作用是记录检测器的测量结果，以备定性和定量计算。简易的分光光度计没有记录仪，直接将结果在电流表或电压表上以指针显示（表头直读），或用数码管以数字显示，再由人工抄录下来备计算。随着计算机的飞速发展，现代分光光度计大多配有微型计算机，不仅能记录光谱图，还能储存各种定性定量程序，可自动进行标准曲线法等各种定量计算，直接显示最终计算结果，直接打印出来。,722型分光光度计的光学系统,分光光度计的结构,分光光度计根据光路结构的不同，可分为单光束、双光束和双波长分光光度计。1、单光束,光源,单色器,检测器,样品池,2、双光束,单光束仪器中，分光后的单色光直接透过吸收池，交互测定待测池和参比池。这种仪器结构简单，适用于测定特定波长的吸收，进行定量。双光束仪器中，从光源发出的光经分光后再经扇形旋转镜分成两束，交替通过参比池和样品池，测得的是透过样品溶液和参比溶液的光信号强度之比。双光束仪器克服了单光束仪器由于光源不稳引起的误差，并且可以方便地对全波段进行扫描。双光束仪器克服了单光束仪器由于光源不稳引起