实验病料的采集

实验二 病料的采集、保存及送检一、目的 掌握被检病料的采取、保存、送检的方法。二、材料 实验动物（鸡）、瓷盘、剪子、镊子、酒精灯、酒精、接种环、载玻片、火柴棒等。三、病料的采取1.采取病料的基本原则(1)采集最适病料 理想的病料，应是无菌采取的含病原微生物量高的血液、器官组织或分泌物和排泄物。因此要根据疾病的病性采取合适的病料，如无法估计是何种疾病时，应根据临床症状和病理变化采集病料或全面采取病料。取材时应注意病原微生物感染所致疾病的类型(如呼吸道感染疾病、胃肠道感染疾病、皮肤和粘膜性疾病、败血性疾病等)、病原微生物的侵入部位、病原微生物感染的靶器官等。细菌检验病料应当是采自未经抗菌药物治疗的患病动物，并且应多做几张涂片。(2)适时采集 采集病料的时间一般在疾病流行早期、典型病急性期，此时病原微生物的检出率高；后期由于体内免疫力的产生，病原微生物减少，检测病原微生物比较困难，同时可能出现交叉感染，增加判断的困难性。在采集供抗体测定用的血清时，可适时地采集急性期和恢复期的两份血清样品，一般两份血清的间隔时间为142ld。内脏病料的采取，须于动物死后立即进行；夏季最迟不超过46h，冬天不超过24h，否则时间过长，由肠内侵入其他细菌，致使尸体腐败，有碍于病原菌的检出。供做切片的样品采取后必须立即投入固定液，否则时间过长，会使细菌和组织细胞死亡、溶解，影响检验结果。有条件做现场培养时，剖开尸体后应进行接种培养，然后采样，最后剖检。(3)无菌操作 采集病料所用的器械及容器要进行严格的消毒：刀、剪、镊子等金属用具可煮沸消毒30min，使用前最好用酒精擦拭，并在火焰上烧一下；器皿（玻制、陶制及珐琅制等）在高压灭菌器或干烤箱内灭菌；软木塞和橡皮塞应高压灭菌；载玻片用2%5%碳酸钠煮沸消毒510min，煮沸后用清水冲洗干净，拭干保存或浸泡于95%酒精中以备使用；注射器和针头放于清洁水中煮沸30min即可，或用一次性注射器。病料采取过程都应该无菌操作，尽量避免杂菌污染。采取一种病料，使用一套器械，或器械酒精擦拭火焰灭菌后再采取另一种病料；一种病料放入一种容器，不可混放。(4)剖前检查 若有突然死亡或病因不明的尸体，须先采取末梢血液制成涂片，镜检，观察是否有炭疽杆菌存在。若疑似炭疽时，不得进行解剖；如需要剖检并获取病料时，应经上级有关部门同意，选择合适的场地，做好严格的防范工作，剖后要进行严格的消毒处理。只有在确定不是炭疽后，方可进行剖检。2.病料采集的方法（1）液体材料 一般用灭菌棉拭子采取破溃的脓汁、鼻液、阴道分泌物与排泄物。未破的脓肿、胸水、腹水在皮肤表面消毒后，用无菌注射器抽取。（2）血液 无菌采取血液，供病原培养、抗体检测和血液检查之用。体型较大的单蹄和偶蹄类动物少量血样可以从耳背静脉采血；毛皮动物少量采血可通过耳壳外侧静脉采取；鼠类可以通过尾尖、耳背静脉、眼窝内血管采血；兔可从耳背静脉、颈静脉、心脏等处采血；鸟类可以从肘关节内侧的翅静脉、跖部内静脉或心脏采血。（3）乳汁 乳房先用消毒药水洗净（取乳者的手也应事先消毒），并把乳房附近的毛刷湿，最初所挤的34股乳汁弃去，然后再采集10ml左右乳汁于灭菌试管中。若仅供显微镜直接染色检查，则可于其中加入0.5%的福尔马林液。（4）淋巴结及内脏组织 应在尸体解剖后立即采取。将淋巴结、肺、肝、脾及肾等有病变的部位各采取12cm3的小方块，分别置于灭菌容器中，并尽可能采取有病变及病变交界处的部位。（5）胃肠及内容物 可将胃肠剪下，两端扎好，送往实验室。或用烧红的器具烧烙表面后穿一小孔，用灭菌棉拭子取其内容物，放入无菌的器皿内或放入装有生理盐水或PBS的试管内。（6）脑、脊髓 按病理解剖方法取出脑、脊髓。取一部分放入10%福尔马林溶液的瓶中，供组织学检查；一部分放入50%甘油生理盐水瓶中，供微生物学检查。或者将头部取下，用塑料口袋包好直接送检。（7）胆汁 先用烧红刀片或铁片烧烙胆囊表面，再用灭菌细管或注射器刺入胆囊内吸取胆汁，置于灭菌试管中。（8）皮肤 去大小约1010cm2的皮肤一块，保存于30%甘油缓冲溶液中，或10%饱和盐水溶液中，或10%福尔马林液中。（9）骨头 需要完整的骨头时，应将附着的肌肉和韧带等全部除去，表面撒上食盐，然后包于浸过5%石炭酸水或0.1%升汞液的纱布或麻布中，装于木箱内送到实验室。(10)流产胎儿及小动物尸体 将流产胎儿及小动物尸体包入不透水塑料薄膜、油纸或油布中，装于木箱内送到实验室。二、病料的保存1.常用保存剂的配制（1）30%甘油缓冲溶液纯中性甘油 30mlNaCl 0.5g碱性磷酸钠 1.0g0.02%酚红 1.5ml中性蒸流水加至 100ml混合分装后，0.105Mpa高压灭菌30min（2）50%甘油缓冲盐水溶液NaCl 2.5g酸性磷酸钠 0.46g碱性磷酸钠 10.74g纯中性甘油 150ml中性蒸流水 150ml混合分装后，0.105Mpa高压灭菌30min（3）10%福尔马林溶液 取福尔马林10ml加入蒸馏水90ml即成。（4）饱和盐水溶液 取一定的蒸馏水加入纯NaCl，不断搅拌至不能溶解为止（一般为38%39%左右），然后用滤纸过滤。（5）鸡蛋生理盐水溶液 先将新鲜鸡蛋的表面用碘酒消毒，然后打开内容物倾入灭菌的三角瓶中，加入灭菌盐水（占总量的10%），摇匀后，用无菌纱布过滤，然后加热至565830min，第2d及第3d按上法再加热一次，即可应用。2.常用保存方法（1）液体病料 检查抗体用的血液，不加抗凝剂，待凝血后，分离血清放入青霉素小瓶中。供病原分离培养用的液体病料，同容器一起放入有冰的保温瓶或4冰箱内。（2）供细菌学检验的实质脏器 若12d内能送到实验室，可放在有冰的保温瓶或冰箱内，也可放入灭菌液体石蜡或30%甘油缓冲盐水内。如无冰，也可在保温瓶内放氯化铵500g加水1500ml，使保温瓶内保持O左右达24h。（3）供病毒学检验的实质脏器 应尽快送检，如不能即刻送检而需要保存时，必须保持在冷的环境中，48h内送到实验室。一般放在50%甘油缓冲盐水溶液或鸡蛋生理盐水溶液中，4保存最好，原因是冻化过程能使病毒破坏。如需保存较长时间才能进行检查，最好放在一20以下或干冰中保存。（4）病理组织病料 采取的病料立即放入10倍体积的10%福尔马林溶液或95%100%酒精中，如用10%福尔马林溶液固定组织时，经24h应重换新鲜液一次。神经系统组织（脑、脊髓等），需固定于10%中性福尔马林溶液内（福尔马林溶液的总容积中加入5%10%碳酸镁）。在寒冷季节，为了避免病料冻结，在运送前，可将预先固定的病料置于含有30%50%甘油的10%福尔马林溶液中。三、病料的送检 供细菌检验用的病料，要防止腐败，必须及时送检。一般可用有冰块的保温瓶或其他低温条件，以使病料不腐败。最好由专人送检，并带