多重耐药及泛耐药菌的监测与防控

多重耐药及泛耐药菌 的监测与防控,内江市中医院检验科 范珍,背 景, 细菌耐药性已成为一个日益严重的全球性 公共卫生问题 。, 世界卫生组织建议各国加强细菌耐药性监 测，严格执行预防和控制措施 。, 卫生部办公厅关于加强多重耐药菌医院 感染控制工作的通知（2008年130文件）,抗菌药物通过杀灭细菌发挥治疗感染的作用,细菌作为一类广泛存在的生物体，也可以通过多种形式获得对抗菌药物的抵抗作用，逃避被杀灭的危险，这种抵抗作用被称为“细菌耐药”，获得耐药能力的细菌就被称为“耐药细菌”。,什么是耐药菌？,多重耐药（MDR）是指一种细菌对原为敏感的3种或3种以上抗菌药物产生耐药。泛耐药（PDR）是指细菌对现有的（或获得的）常用抗菌素药物除多粘菌素B敏感外其余全部耐药，如PDR AB、 NDM-1。,什么是多重耐药和泛耐药？,目标性监测的多重耐药菌, 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA ） 以及VISA、VRSA, 耐万古霉素肠球菌(VRE),产超广谱-内酰胺酶(ESBLs)细菌 质粒介导AmpC酶细菌,多重耐药、泛耐药的鲍曼不动杆菌多重耐药、泛耐药的铜绿假单胞菌, 碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌,包括NDM-1、KPC,目标性监测的人群, 多重耐药菌感染患者或定植高危患者,长期收治ICU的患者,接受过广谱抗菌药物治疗 抗菌药物治疗效果不佳的患者 留置各种管道的患者, 以上患者要进行定期监测和主动筛查，及 时发现、早期诊断多重耐药菌感染患者和 定植患者。,完善准确实时的耐药监测, 基于：,加强微生物实验室的能力建设,建立病原菌鉴定和药敏试验的标准操作规程 提高多重耐药菌株检测的准确性、可靠性,才能建立完善、准确、实时的耐药监测网 络和感染控制体系！,NDM-1的检测与监测,NDM-1概况, 2008年首次在一名瑞典病人感染的大肠杆 菌和肺炎克雷伯菌中确认了这种酶的存在， 并将之命名为NDM-1。, 2010年8月英国柳叶刀传染病上介绍这 些细菌跨国传播现状的文章。, 2010年9月卫生部发电做好“超级细菌”的 应对工作,何谓“超级细菌”NDM-1, NDM-1:全称新德里产金属-内酰胺酶- (New Delhi metallo-lactamase 1) NDM-1属于一种新命名的金属-内酰胺酶 (金属碳青霉烯酶）,-内酰胺酶分类, -内酰胺酶分为A、B、C、D四类,A类酶:主要由质粒介导，对-内酰胺类抗生 素有不同程度耐药。主要有ESBL及耐酶抑制 剂的广谱酶（IRT）。,B类酶：又称金属酶。可由染色体、质粒或转 座子介导，由后者编码的金属酶可见于铜绿 假单胞菌和不动杆菌和肠杆菌科细菌。,-内酰胺酶分类,C类酶：主要有AmpC酶。对三代头孢、酶抑制 剂、头霉类耐药、对碳青霉烯、四代头孢敏感。 D类酶：染色体介导的耐酶抑制剂的青霉素酶。 对头孢类抗生素敏感性不定，对氨曲南、碳青 霉烯敏感。,B类金属酶, B类金属酶能破坏青霉素类、头孢类、 碳青霉烯类等抗生素。被EDTA所抑制。 目前，产金属酶菌株的感染在治疗上 尚棘手。, 金属-内酰胺酶除NDM-1外，还有IMP、 VIM、GIM、SIM、SPM等表型。,携带NDM-1基因的细菌种类,目前发现携带有NDM1的细菌主要为大肠 杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、摩氏 摩根菌、鲍曼不动杆菌、肠球菌等。 以大肠埃希菌(E. coli)和肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)居多.,NDM-1的传播,医院感染可能是该细菌传播的重要途径,污染的医疗器械;,污染的医疗用品; 污染的手,中国应对“超级细菌”的措施,进一步加强抗菌药物合理应用的管理 加强对重点患者的检测和监测 进一步加强医院感染预防与控制 加强相关知识宣传和公众教育,NDM-1实验室检测方法,1,表型筛查,2,表型确认,3,基因确证,卫生部产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌感染诊疗指南 (试行版） ,（一） 表型筛查, 纸片扩散法：, 美罗培南（10ug）或亚胺培南（10ug）： 抑菌圈直径22mm, 肉汤稀释法或Etest法, 美罗培南MIC2mg/L；, 或亚胺培南对大肠埃希菌、克雷伯菌属、沙门 菌属和肠杆菌属MIC2mg/L。, 厄他培南特异性较低，不推荐用于筛查试验,卫生部产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌感染诊疗指南(试行版） ,（二） 表型确认, 用碳青霉烯类及螯合剂（EDTA）确认金属,-内酰胺酶的存在：,纸片扩散法,Etest法,双纸片协同法, 自动化鉴定与药敏仪器,.,（二） 表型确认,1.纸片扩散法：亚胺培南(10ug)和亚胺培南 (10ug)+ EDTA(500mM 10ul)复合纸片,结果判读：复合纸片比单药纸片抑菌环直径增 大5mm,图：复合纸片法判定金属-内酰胺酶示意图 (左纸片：亚胺培南/EDTA, 右纸片：亚胺培南),1 Yong D et al. J Clin Microbiol. 2002 Oct;40(10):3798-801.,（二） 表型确认,2.Etest法：,Etest MBL (IP/IPI、MP/MPI),结果判读：单药与复合制剂的MIC比值8,图：Etest,MBL (IP/IPI),1 /servlet/srt/bio/clinical- diagnostics/dynPage?doc=CNL_CLN_PRD_G_PRD_CLN_60,（二） 表型确认,采用亚胺培南(10g)、EDTA（1500g） 两 纸片进行K-B法，两纸片距离10-15mm， 在含EDTA纸片方向处，亚胺培南抑菌圈扩大， 即可判定产金属酶。,图：亚胺培南-EDTA双纸片协同试验 示意图 (图中菌种为铜绿假单胞菌),1 Lee K et al. J Clin Microbiol. J Clin Microbiol. 2003 Oct;41(10):4623-9.,自动化鉴定药敏仪器, 自动化仪器药敏设备能有效监测碳青霉烯 耐药肠杆菌（CRE）,药敏卡含有碳青霉烯类药物 可设置CRE自动预警 报告碳青霉烯酶耐药表型,（三）NDM-1基因确证试验, 基因确证:最后用分子生物学的方法才能鉴 定NDM-1金属酶,采用NDM-1的基因特异引物进行PCR扩增及 产物测序，确定菌株是否携带blaNDM-1基因。,卫生部产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌感染诊疗指南(试行版） ,NDM-1实验室检测要求, 对阳性结果须加以复核，同时将菌株 送有条件的参考实验室进一步检测确 证。, 建立并严格执行NDM1报告制度，对表型 确认和/或基因确证阳性菌株12h内上报。,实验室药敏试验检测要求, 微生物实验室应扩大药敏试验的抗菌药,物种类:至少包括内酰胺类的碳青霉烯 类（美洛培南或亚胺培南）、氨基糖苷类、 喹诺酮类，建议增加替加环素、米诺环素、 磷霉素、多粘菌素等,KPC酶的检测与监测,碳青霉烯酶, 什么是碳青霉烯酶？,能水解或灭活碳青霉烯类（例如：亚胺培南，美 罗培南）的-内酰胺酶,分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类酶,碳青霉烯酶, 碳青霉烯酶的临床意义是什么？,在治疗由革兰阴性杆菌引起的严重感染时，碳 青霉烯类是重要的抗生素，但是它不能有效的 抑制产碳青霉烯酶的细菌。,在革兰阴性杆菌中，碳青霉烯酶出现的频率越 来越多。,碳青霉烯类耐药机制,碳青霉烯类,耐药机制,AmpC酶加,产水解碳青霉,青霉素结合蛋,主动外排系统,外膜缺失或改变,烯类酶,白亲和力的减少,碳青霉烯酶,分类,酶的种类,常见的产生菌,Class A,KPC-1-10,肠杆菌科,SME, IMI, NMC, GES,(铜绿中报道较少),Class B,IMP, VIM, GIM, SPM,铜绿假单胞菌,(金属-内酰胺酶),NDM-1,肠杆菌科细菌,不动杆菌属,Class D,OXA-23至OXA-27、,不动杆菌属,40、48、54,产KPC酶的肠杆菌科细菌耐药特点, KPC酶：Klebsiella pneumoniae carbapenemase 肺炎克雷伯菌产生的一种碳青霉烯酶, 所有的 -内酰胺类耐药, 青霉素类,广谱头孢菌素 单环B内酰胺类 碳青霉烯类, 质粒介导的耐药基因, 有的菌株同时 ESBL（+）：氟喹诺酮类耐药、氨基 糖苷类耐药,35,产KPC酶的肠杆菌科细菌特征,MIC (g/ml),MIC (g/ml),阿米卡星,R,环丙沙星,R,氨苄西林,R,厄他培南,R或I,氨苄西林-舒巴坦 R,庆大霉素,R,氨曲南,R,亚胺培南,R或I,头孢唑林,R,左氧氟沙星,R,头孢匹肟,R,美罗培南,R或I,头孢西丁,R,哌拉西林-他唑巴坦 R,头孢他啶,R,四环素,R,头孢曲松,R,妥布霉素,R,39,氯霉素,R,复方磺胺,R,KPC酶实验室检测方法, 采用改良Hodge试验, PCR直接检测KPC酶基因,改良Hodge试验检测肠杆菌科碳青霉烯酶,E. coli,ATCC,厄他培南抑制 E. coli,25922,ATCC 25922,#1 pos,1. 制备 0.5McF的 E. coli ATCC 25922菌悬液. 1:10稀释,2. 用棉签均匀涂布 MHA 平皿、 约5分钟，中心贴厄他培南或 美罗培南纸片,3. 用1 ul接种环挑取2-3个菌落，,#2 pos,从纸片边缘向外划线,#3 neg,4. 过夜培养（16-20h）. 5. 出现向内生长的菌株为碳青霉 烯酶阳性（如图1，2）.,有丰富菌的E. coli ATCC 25922生长,CLSI M100-S20.,KPC酶检测, 改良Hodge试验：,厄他培南是检测KPC酶的最佳底物,发现KPC酶的敏感性90% ，特异性90%； 其他碳青霉烯酶存在时试验也呈阳性,KPC酶基因确证： PCR直接检测KPC酶基因,CLSI M100-S20中碳青霉烯类的折点（2010）,纸片扩散法 (mm),稀释法(mg/L),抗菌药物,M100-S20,M100-S20-U,M100-S20,M100-S20-U,S R,S R,S R,S R,多利培南,-,23,19,-,1,4,厄他培南 19 15,23,19,2,8,0.25,1,亚胺培南,16 13,23,19,4,16,1,4,美罗培南,16 13,23,19,4,16,1,4,用新碳青霉烯折点时还要作改良 Hodge试验吗？, 临床报告不要, 感控时，需要,报告碳青霉烯药物结果的方式,假如碳青霉烯酶阳性且碳青霉烯药物的MIC值在敏感范围（如厄他培南2或亚胺培南 4）则： - 报告碳青霉烯药物的MIC，不解释结果。 - 隐藏MIC，直接报告碳青霉烯药物耐药。 - CISL建议在报告中注明：此菌产碳青霉烯 酶，如碳青霉烯药物体外敏感，但疗效尚未明确。,产碳青霉烯酶菌株的治疗,产KPC菌株对所有常用抗生素耐药，但对多粘菌素B、替加环素敏感性高，在国外已经使用。尿液中浓度低，替加环素不推荐用于尿道感染。合理使用抗生素，加强消毒、隔离院感控制措施刻不容缓。,其它耐药机制的检测与监测,2005-2010年北京协和MRSA检出率,2005年-2010年主要革兰阳性菌的耐药菌检出率（%）,100,90,80,72.4,70,65.3,66,63.7,61.5,60,59.7,MRSA,50,VRE,40,30 20,10,2.6,2.7,3.2,2.1,3.2,0,0,2005年,2006年,2007年,2008年,2009年,2010年,金葡菌主要耐药机制,MRSA产生青霉素PBP2a(mecA基因码) VISA细胞壁成分产生过多，与万古霉素结合量少, VRSAmecA,vanA基因(与肠球菌接合转移) 细菌产生一种连接酶，导致合成D-丙氨酰- D-乳酸代替正常胞壁成分，与万古霉素亲 和力低，因此不能抑制VRSA的细胞壁合成。,MRSA 耐药性检测, MRSA定义：凡对甲氧西林、苯唑西林、 头孢西丁耐药，或PBP2a阳性、 mecA基 因阳性的金黄色葡萄球菌。,MRSA 耐药性检测,筛查MRSA最简单方法是MRSA显色培 养基, 检测MRSA最准确 的方法：检测mecA 基因或mecA基因表 达的青霉素结合蛋 白（PBP2a),PBP2a阳性,MRSA 耐药性检测,表型确认试验： 头孢西丁纸片扩散法： 以头孢西丁为替代物报告苯唑西林的结果。 苯唑西林MIC法： 乳胶凝集试验检测PBP2a： 注意：对于金黄色葡萄球菌，只要头孢西丁或苯唑西林任一种药耐药则报告苯唑西林耐药。,葡萄球菌耐药性解释标准,MRSA 检测结果解释,苯唑西林敏感：提示对青霉素酶稳定的青霉素类（氯唑西林、 内酰胺/ 内酰胺酶抑制剂复合制剂、头霉素、碳青霉烯酶类）敏感。苯唑西林耐药：提示对内酰胺类抗生素耐药，即使体外敏感，也不能报告。,MRSA 感染的治疗,治疗原则： MRSA对全部内酰胺类抗生素耐药，对大环内酯类、氨基糖苷类、喹诺酮类常常同时耐药，糖肽类抗菌药（如万古霉素）是治疗MRSA 的最佳选择。,万古霉素中介/耐药的葡萄球菌,（VISA 、VRSA）, 1997年日本首先报告了对万古霉素中介的葡 萄球菌，美国和法国也有报告, 美国2002年报告首例VRSA，使葡萄球菌感 染再次成为非常棘手的问题。2002年07年 在北美地区先后共确定9株耐药的金黄色葡萄 球菌(VRSA), 如果MRSA对万古霉素的疗效不好应考虑 VISA / VRSA,VISA/VRSA检测, 测,感,性, 自,EK及,W,的,M, 因,选平,板,然检,测,VISA/VRSA检测, 检测到万古霉素MIC 4g/ml 任何金黄色 葡萄球菌，应送到参考实验室进行检测。,2010年CLSI M100-S20,鉴于世界范围内仅9株VRSA，因此CDC报道金葡菌对万古霉素中敏/耐药十 分慎重，需要一个严谨而复杂的流程并得到CDC中心实验室最终确认如下：,可以接受的初步实验方法包括,MIC检测万古霉素金葡菌筛选平板,MIC检测万古霉素金葡菌筛选平板,（含有6g/ml万古霉素脑心浸液平板）,（含有6g/ml万古霉素脑心浸液平板）,万古霉素,万古霉素,万古霉素抑菌圈,万古霉素抑菌圈,万古霉素抑菌圈,MIC2g/ml同时,MIC4g/ml同时/,=6mm和/或筛选平,7mm和/或筛选平板,7mm和/或筛选平板,筛选平板没有细,或筛选平板有细,板有细菌生长,有细菌生长,没有细菌生长,菌生长,菌生长,可能是VISA/VRSA,可能是VISA/VRSA,报告VSSA,报告VSSA前进行 MIC检测,检测菌株的纯度 确认菌株ID,VSSA：万古霉素敏感金葡菌MIC 2g/ml VISA：万古霉素中介金葡菌MIC 4-8g/ml,MIC检测方法重新检测,VRSA：万古霉素耐药金葡菌MIC16g/ml,保存菌株,报告院内感染控制部门，医生，地方公共卫生部门以及CDC“可能检测到VISA/VRSA” 将可以VRSA(MIC8g/ml)菌株送至CDC中心实验室检测耐药基因（Van）以及MIC值重新确认 /ncidod/dhqp/pdf/ar/VRSA_testing_algo09v4.pdf,国内葡萄球菌对万古霉素保持,100%敏感,2009年中国CHINET细菌耐药性监测结果,100%,100%,100%,98%,2008年 MRSA中国现状,96%,94% 92%,90%,金葡菌,凝固酶阴性葡萄球菌,(n=3525),(n=2313),汪复,朱德妹,胡付品等. 2009年中国CHINET细菌耐药性监测.中国感染与化疗杂志 2009, 9(5):321-329.,耐万古霉素肠球菌（VRE）, 已报道：Van A、 Van B、 Van C、 Van D 、Van E、 Van G 6个表型, Van C型为固有耐药，其它为获得性耐药。,耐万古霉素肠球菌的监测, 有许多的方法可检测VRE,纸片扩散法在检 测低水平耐万古霉素肠球菌（ Van B 、 Van C）时，敏感性降低。, 鸡肠球菌和铅黄肠球菌对万古霉素的MIC值 在8-16g/ml （中介），是天然中等水,水平耐药株（ VanC），是不需要进行感染控制的耐万古霉素的肠球菌（VRE），它不属于真正的VRE。,VRE感染的治疗,氨苄西林+高浓度庆大霉素或链霉素、环丙沙星+高浓度庆大霉素或链霉素、替考拉宁+环丙沙星。对于耐青霉素+氨苄西林+万古霉素+HLAR的屎肠球菌，可选用利奈唑胺或喹奴普叮。,ESBLs检测,灭活（水解）超广谱-内酰胺药物。不水解头霉素类。可被-内酰胺酶抑制剂抑制（如克拉维酸）。产ESBLs菌株导致的血流感染通常与高死亡率有关。在医院容易引起暴发流行，对感控很重要。,ESBLs的检测方法,CISI推荐的ESBLs初筛和确认试验双纸片协同法E-test法自动化仪器其他方法,ESBLs的初筛试验,ESBLs初筛试验（K-B法与MIC法） 抑制圈（mm） MIC（ug/ml） 头孢他啶 22 1 头孢噻肟 27 1 头孢曲松 25 1 如结果符合以上标准，则大肠杆菌，克雷伯菌和奇异变形杆菌则为可疑产ESBLs。,ESBL阳性确证试验,26 mm,头孢噻肟/克拉维酸,10 mm,头孢他定/克拉维酸 头孢他定,头孢噻肟,头孢噻肟/克拉维酸抑菌圈比头孢噻肟抑菌圈5mm 头孢他啶/克拉维酸抑菌圈比头孢他啶抑菌圈5mm 以上结果只要出现一种，即可判定为产ESBLs,ESBLs的检测结果解释,一旦产生ESBLs，则对青霉素类、头孢类和氨曲南耐药，但对碳青霉稀类、 -内酰胺/酶抑制剂复合类抗菌药和头霉素类敏感。 S修改为R S不能修改R 青霉素类 头孢类 头霉素类 阿莫西林 头孢噻吩 头孢西丁 哌拉西林 头孢吡肟 头孢替坦 氨苄西林 头孢呋辛 头孢美唑,ESBLs检测的新规则, 过去CLSI推荐对大肠埃希菌、肺炎克雷伯 菌、产酸克雷伯菌、奇异变形杆菌进行常规ESBLs的确认试验 。, 2010 CLSI 对肠杆菌科细菌建立了新的头 孢菌素类的判断标准，在使用新的判断标 准时，没有不要再做常规ESBLs检测和报 告修改，仅在流行病学调查和感染控制时检测 ESBLs。,ESBLs菌株感染的治疗,严重感染，可首选碳青霉稀类抗生素。轻、中度感染可选用头孢哌酮/舒巴坦和头霉素类等，疗效不佳时改用碳青霉稀类抗生素。头孢他啶、头孢吡肟体外敏感性高和感染部位浓度高时可选用，但需密切观察。,质粒介导的AmpC酶, 临床意义,可以引起大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、 假单胞菌属、不动杆菌属等常见细菌的暴发流 行,AmpC酶结合膜屏障机制可引起细菌对碳青霉烯类耐药,此酶在动物和环境中均可发现 抗菌药物治疗受到限制,质粒AmpC 酶在中国的分布,DHA-1 (哈尔滨),DHA-1, ACT-1, CMY-2 (北京),DHA-1, (天津),DHA-1,CIT,ACT-1 CMY-2 (上海) DHA-1、2 (浙江) DHA-1, CMY-2 (湘雅),DHA-1, CMY-2 CMY-22(福建) DHA-1,ACT-1 (广州),DHA-1 是中国主要的流行质粒介导的AmpC酶,AmpC酶检测方法, AmpC酶表型筛选试验：,临床实验室通常根据耐药表型（二、三代 头孢菌素耐药、双纸片协同试验阴性、对 四代头孢菌素敏感）综合判断。 氯唑西林双抑制剂扩散协同试验 头孢西丁三维试验, 等电点聚焦及氯唑西林抑制试验 分子生物学技术,AmpC酶检测用药规则,对第三代头孢菌类、单环-内酰胺酶类（如氨曲南）、头霉素类耐药，大多不能被-内酰胺酶抑制剂抑制。但对碳青霉烯类（如亚胺培南）敏感。对第四代头孢菌敏感且不能被酶抑制剂所抑制（如克拉维酸）。,泛耐药菌株的鉴定, 细菌：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌 表现为对常规药敏试验的药物均耐药 如何确定PDR和增加药敏试验种类？ 纯化菌种,重新鉴定和药敏试验,可增加药敏试验药物：多粘菌素/粘菌素、替加环 素、米诺环素,协同药敏试验,北京协和医院碳青霉烯耐药监测情况,2004年-2010年亚胺培南对主要非发酵菌的耐药率变迁,100,90,80 70 60,铜绿假单胞