DB32T 3802-2020 南美白对虾肠肝孢虫聚合酶链式反应(PCR)检测方法

ICS65.150B 51DB32江苏省地方标准DB32/T 38022020南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法Detection of Enterocytozoon hepatopenaei in Litopenaeus vannamei by nested PCR2020 - 05 - 25发布2020 - 06 - 25实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T 38022020前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由江苏省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：江苏省海洋水产研究所。本标准主要起草人：万夕和、沈辉、乔毅、史文军、王李宝、黎慧、蒋葛、成婕、范贤平。5南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法1 范围本标准规定了南美白对虾（Litopenaeus vannamei）肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）巢式聚合酶链式反应（polymerasw chain reation，PCR）检测方法的原理、试剂材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本标准适用于南美白对虾样品中肝肠孢虫带虫情况的高灵敏定性检测。其他环境生物和饵料生物，以及非生物样品中肝肠胞虫带虫情况检测可参照此方法。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 258782010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）检测 PCR法SC/T 7202.22007 斑节对虾杆状病毒诊断规程 第2部分：PCR检测法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 肝肠胞虫 Enterocytozoon hepatopenaei一种感染对虾肝胰腺、肠道等器官的微孢子虫，可致南美白对虾生长缓慢，养殖产量严重下降。4技术原理南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应（PCR)检测方法是以样品DNA为模板，针对其胞壁蛋白基因设计两对特异性巢式寡核苷酸序列为引物，在四种脱氧核糖苷三磷酸存在下，利用DNA聚合酶的合成作用，经过先后两步数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两对引物间的DNA片段得到特异性巢式扩增，通过电泳检测扩增片段是否存在。5试剂材料5.1在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂。5.2实验用水为无菌蒸馏水或超纯水。5.3无水乙醇。5.4液体石蜡。5.5二氧化氯消毒剂。5.6电泳琼脂糖。5.7 1 kb DNA Marker。5.8 Tris平衡酚。5.9 Taq DNA聚合酶（5 U/L）。5.1010PCR缓冲液，无Mg2+，随Taq DNA聚合酶提供。5.11氯化镁溶液（25 mmol/L）。5.12dNTP（含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10 mmol/L的混合物）。5.1320 mg/mL 蛋白酶K。5.14TE缓冲液、抽提缓冲液、1电泳缓冲液、6载样缓冲液。5.1510 mol/L乙酸铵。5.16酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）。5.17核酸染料。5.1870%乙醇。5.19阳性对照为已知受EHP感染的南美白对虾样品；阴性对照为已知未受EHP感染的南美白对虾样品；空白对照为无菌双蒸水。6仪器设备所需仪器设备按照SC/T 7202.22007中第6章的规定。所有非一次性使用的器具应经清洗，浸于新配制的有效氯3.010-3的二氧化氯消毒剂中5 min，经无PCR产物污染的蒸馏水或超纯水充分淋洗干净后方可用于检测。7操作步骤7.1样品准备取活体或冰冻南美白对虾或其他生物样品50 mg100 mg（环境沉积物样品约500 mg），放入灭菌的1.5 mL离心管中，避免样品间交叉污染。7.2DNA的提取样品DNA的提取参照SC/T 7202.22007中7.1.3执行。7.3PCR反应体系准备7.3.1巢式第一步PCR的反应的模板为抽提的样品DNA，其反应预混物组成及反应条件见表1。表1 巢式第一步PCR反应预混物组成及反应条件试剂25 L体系（L）50 L体系（L）10PCR缓冲液（无Mg2+）2.55MgCl (25mmol/L)24DNA模板0.51dNTP(10 mmol/L)12100 ng/L 引物F1：5-TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT-312100 ng/L 引物R1：5-CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC-312Taq DNA聚合酶（5U/L）0.250.5灭菌双蒸水16.7533.5扩增程序：95 预变性5min；95 30s、58 30s、68 45s，30次循环；68终延伸5min。4保温产物大小：514bp7.3.2巢式第二步PCR的反应模板为稀释1000倍后的第一步PCR产物，反应预混物组成及反应条件见表2。表2 巢式第二步PCR反应预混物组成及反应条件试剂25 L体系（L）50 L体系（L）10PCR缓冲液（无Mg2+）2.55MgCl2 (25mmol/L)24DNA模板（第一步PCR产生稀释1000倍）0.51dNTP(10 mmol/L)12100 ng/L 引物F2：5-TTGGCGGCACAATTCTCAAACA-312100 ng/L 引物R2：5-GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-312Taq DNA聚合酶（5U/L）0.250.5灭菌双蒸水16.7533.5扩增程序：95 预变性5min；95 30s、64 30s、6820s，20次循环；68终延伸5min。4保温。产物大小：148bp7.3.3甲壳类动物内参基因PCR的反应模板为抽提的南美白对虾样品DNA，其反应预混物组成及反应条件见表3。表3 甲壳动物内参基因PCR反应预混物组成及反应条件试剂25 L体系（L）50 L体系（L）10PCR缓冲液（无Mg2+）2.55MgCl2 (25mmol/L)24DNA模板0.51dNTP(10 mmol/L)12100 ng/L 引物F：5-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-312100 ng/L 引物R：5-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-312Taq DNA聚合酶（5U/L）0.250.5灭菌双蒸水16.7533.5扩增程序：94 预变性5min；94 1min、55 1min、72 1min，35次循环；72终延伸5min。4保温。产物大小：848bp7.3.4分别配制好100份1000份第一步PCR、第二步PCR和甲壳类动物内参基因PCR的无Taq DNA聚合酶的反应预混物，按10份/支、100份/支对无酶反应预混物分别分装，冻存于-20。7.3.5检测前，取出所需份数的PCR无酶预混物解冻，按比例分别加入所需的Taq酶量，混匀；按1份/支将预混合物分别分装到0.2 mL PCR管中待用。7.4PCR操作7.4.1巢式第一步PCR按照表1在含Taq酶的预混物PCR管中分别加入相应量样品DNA、阳性对照、阴性对照和空白对照模板，然后按扩增程序进行PCR反应。7.4.2巢式第二步PCR按照表2在含Taq酶的预混物PCR管中分别加入相应量稀释后的第一步PCR产物，然后按扩增程序进行PCR反应。7.4.3甲壳类动物内参基因PCR（除南美白对虾样本外，其他样本不执行此步骤）按照表3在含Taq酶的预混物PCR管中分别加入相应量样品DNA、阳性对照、阴性对照和空白对照模板，然后按扩增程序进行PCR反应。7.5PCR产物分析7.5.1琼脂糖凝胶制作7.5.1.1 用1电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，装于250 mL三角瓶中，胶液体积应少于容器体积的1/4，在电炉上或微波炉中加热至溶液完全透明。待溶液冷却至60左右，按要求加入核酸染料，摇匀。7.5.1.2 将凝胶液缓缓倒入设置好的水平放置的凝胶船，胶液厚度0.6 cm0.8 cm。梳底部水平深入胶层约0.3 cm0.5 cm，并距凝胶底部0.2 cm。7.5.1.3 待凝胶完全凝固后，小心拔掉梳齿，去掉防漏条/套。7.5.2电泳 PCR产物电泳参照SC/T 7202.22007中7.1.6执行。7.5.3结果的分析和问题排除电泳结果的分析和问题排除方法参见GB/T 258782010 附录B。8结果判定8.1阳性对照、阴性对照和空白对照均检测准确的条件下检测结果有效（若样品为南美白对虾还需同时满足甲壳动物内参基因有检出），若样品巢式第一步PCR产物在514bp处有特定条带，或巢式第一步无特定条带