免疫学技术与方法

1,第十三章免 疫 学 技 术 与 方 法,2,免疫学技术是指利用抗原抗体反应的特异性原理，建立各种检测与分析技术以及建立这些技术的制备方法。分为： 免疫检测技术（血清学技术） 细胞免疫技术 免疫制备技术,免疫学技术,3,血清学技术的类型 （免疫检测技术）,凝集反应沉淀反应补体结合反应免疫标记技术,4,指与细胞免疫有关的各种检测技术，包括对免疫细胞、细胞因子的检测及功能分析。,细胞免疫技术,淋巴细胞分离与检测淋巴细胞功能测定细胞因子测定体内细胞免疫试验,E玫瑰花环试验T细胞亚群检测技术,淋巴细胞转化试验细胞毒性T细胞试验巨噬细胞移动抑制试验,白细胞介素测定干扰素测定,皮肤试验,5,免疫制备技术,指制备与免疫检测有关的各种试剂，包括抗原制备、抗体制备及抗体标记等技术。,6,体内,杀菌、溶菌、调理、中和毒素免疫病理损伤超敏反应、免疫性疾病等,体外：凝集、沉淀、溶细胞、中和毒素、补体结合等,又称：serological reaction血清学实验,第一节 抗原抗体反应原理及特点,7,一、抗原抗体反应的原理,基本原理：,特异性（epitope-HVR）,可见性（凝集、沉淀、溶血等）,结合力(4种),8,高度互补（epitope-HVR）紧密接触,结合力,抗原抗体,9,1.静电引力 指带电离子基团（如：NH3+和 COO-） 之间的引力，距离越近引力越大。,10,2.范德华力,分子间（或原子间)相互接近，分子极化产生引力，其作用取决于分子空间构型，如：凹槽与凸起互补，抗原与抗体，酶与底物。能量小于静电引力。,11,（3）氢键结合力,指供氢体氢原子与受氢体原子之间的引力“氢键桥梁” ，能量大于范德华引力。,12,4.疏水作用力,指疏水基团间排斥水分子，相互聚集的力。作用力最强，占总结合力的50。,13,结合力的大小,表示,14,一个抗体结合点与一个抗原表位间的结合强度。 “（single point single point ）” 亲和力用平衡常数表示：K=K1/K2,亲和力（affinity）：,即：结合常数/解离常数 K值越大，亲和力越高，与抗原的结合越牢固,15,亲合力（avidity）,指整个抗体分子与抗原之间结合的强度 “all points-all points”与抗体的结合价直接相关。亲合力高，与抗原结合牢固不易解离。,16,二、抗原抗体反应的特点,（一）特异性（specificity）,免疫学检测中常用已知Ag 检测未知Ab ，反之亦然。,17,（二）比例性 (proportionality),指抗原抗体的量比关系，即只有当抗原抗体的浓度比例适当时，才出现可见反应。,1929年Heidelberger以固定Ab量逐渐增加Ag量的试验发现带现象。1977年Green把此现象称为钩状效应（hook effect），包括前后带现象。指免疫检测中由于抗原、抗体浓度比例不合适而致检测结果呈假阴性的现象。,18,抗原抗体反应比例性示意图,19,1、带现象:在抗原抗体反应等价带前后,由于抗体或抗原过量,上清液中可测出游离的抗体或抗原,形成的沉淀物少,不出现可见反应,这种现象称为带现象2、等价带:抗原抗体反应曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围,称为抗原抗体反应的等价带。在此范围内,抗原抗体充分结合,沉淀物形成快而多。 3、前带现象:抗原抗体反应当抗体量过剩时,不出现可见反应。4、后带现象:抗原抗体反应当抗原量过剩时,不出现可见反应。,20,网格学说（图）,抗体的两个Fab段分别结合两个Ag分子，相互交叉结合连接成巨大的网格状立体聚合物，（可见）。,二者比例合适：,网格学说,21,Ab/Ag过剩过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复合物（不可见）。,22,确定 的浓度非常重要，即在实验中需对Ag/Ab进行适当的 ，调整二者的比例，产生可见反应。一般原则：固定 含量（ Ag/Ab ）的浓度，稀释 含量的 (Ab / Ag)。一般可溶性Ag稀释 ，颗粒性Ag，稀释 。,Ag/Ab,稀释,低,高,Ag,Ab,23,（三）可逆性（reversibility）,24,（四）阶段性,特异性结合,两个阶段,可见反应阶段,数秒数分钟， 肉眼不可见,数分数小时肉眼可见,25,（一）电解质 作用：中和胶体表面电荷，破坏水化层， 使Ag-Ab聚集。 常用：0.85% 生理盐水，PBS、Ca2+、 Mg2+等。 盐析（salting）即电解质浓度过高引起的非特异性蛋白质沉淀。,三、影响抗原抗体反应的因素,26,（二）酸碱度,Ag、Ab多为蛋白质，具两性电离特性，有其故有的pI , pH过高或过低均可影响Ag、Ab反应。一般：pH68为宜。注意：自凝现象即pH达到或接近颗粒性抗原的pI时，引起的抗原非特异性自身凝集现象。 酸凝pH过低时造成的蛋白质自凝现象。,27,（三）温度影响反应速度,一般：1540 为宜，最适温度：37, 过高（56 ）: Ag-Ab解离，Ag、Ab变性，补体失活。冷凝集试验：由肺炎支原体感染引起的原发性非典型性肺炎患者的血清中常含有较高的寒冷红细胞凝集素，简称冷凝集素，它能与患者自身红细胞或“O”型人红细胞于4条件下发生凝集，在37时又呈可逆性完全散开。发病后第二周血清中冷凝集素效价达1：32以上，一次检查凝集价1：64或动态检查升高4倍以上时，有诊断意义。,28,免疫学检测技术的评价标准Specificity（特异）：检测信号针对性和排他性Sensitivity（灵敏）：可测出的最低含量Simplicity（简便）：操作是否方便Safety（安全）：是否有污染，对操作者的伤害Saving（节约）：性能/价格比,29,免疫检验技术发展进程的主要阶段,自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应）加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了反应过程标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合,30,抗原抗体反应的基本类 型 表反应类型 实验技术 检测方法 敏感度,沉淀反应 液相沉淀试验 观察沉淀、检测浊度 +，+ 琼脂凝胶扩散 观察扫描沉淀线或环 + 凝胶电泳技术 或峰或弧 +,补体参与反应 补体溶血试验 以裸眼或光电比色仪 + 补体结合试验 观察测定溶血现象 +,免疫标记技术 荧光免疫技术 检测荧光现象 + 放射免疫技术 检测放射性 + 酶标免疫技术 检测酶底物显色 + 发光免疫技术 测定发光强度 + 生物素-亲合素技术 结合其它标记技术 + 金标免疫技术 检测金颗粒沉淀 +,凝集反应 直接凝集试验 用裸眼、放大镜或显 + 间接凝集试验 微镜观察红细胞或胶 + 凝集抑制试验 乳等颗粒和各种凝集 + 协同凝集试验 现象 + 抗球蛋白试验 +,中和反应 病毒中和试验 病毒感染性丧失 + 毒素中和试验 外毒素毒性丢失 +,31,一、凝集反应（Agglutination）,颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块称为凝集反应。,第二节 常见免疫检测方法,32,33,2、凝集反应的用途（1）定性检测 即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性（2）定量检测 即将标本作一系列倍比稀释后进行反应，以出现50%凝集的最高稀释度作为滴度。,凝集反应方法简便，敏感性高，临床应用广泛。,34,3、凝集反应的分类,35,（一）直接凝集试验（Direct agglutination）,36,1、玻片凝集试验,37,2、试管凝集试验,38,（二）间接凝集试验 indirect agglutination,39,40,1、正向间接凝集反应,41,2、反向间接凝集反应,42,3、间接凝集抑制反应,43,4、协同凝集反应（coaggoltination）,44,可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。,二、免疫沉淀反应,45,液相沉淀反应,凝胶扩散沉淀,凝胶免疫电泳,絮状沉淀,环状沉淀,免疫浊度沉淀,单向琼脂扩散试验,双向琼脂扩散试验,血清免疫电泳,火箭电泳,对流免疫电泳,免疫印迹等,46,1、絮状沉淀试验,操作步骤：（1） 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。（2） 各管加入一定浓度的适量抗血清。（3） 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37孵育。（4） 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。,（一）液相沉淀反应,47,2、环状沉淀试验,操作步骤：（1） 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（550mm）底部，避免产生气泡。（2） 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（3） 置沉淀管于室温下使其反应，15min内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 （诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。,48,3、 凝胶扩散沉淀,凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部位相遇形成沉淀线的反应。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。最常用的方法为： 单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验,49,（1）单向琼脂扩散试验,原理：12%的琼脂凝胶形成网状构架，空隙中是98-99%的电解质溶液。凝胶网孔较大，允许分子量在20万以下甚至更大些的大分子物质通过，绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在20万以下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处发生沉淀，此沉淀物因颗粒较大而不扩散，故形成沉淀带。,50,单向免疫扩散试验示意图,51,（2）双向免疫扩散试验,双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。,52,53,3、免疫电泳技术,免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。两大优点：一是加快了沉淀反应的速度 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫印迹等,54,（1）血清免疫电泳,将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加。,55,56,（2）火箭免疫电泳,火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度的单向扩散。,57,是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的蛋白成分。广泛应用于检测蛋白表达。,（3）免疫印迹western blot,58,59,免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射性核素等标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应。免疫标记技术既可对样品作定性、定量检测，也可进行定位分析，且大大提高了方法的灵敏度，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。,四、免疫标记技术,60,常见标记免疫技术,放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术化学发光免疫技术免疫胶体金技术免疫印迹技术蛋白质芯片技术,61,该法是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的灵敏度（pg）和自动化检测等特点，因此在实验研究和临床检测中仍被广泛应用。主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等小分子化合物的定量分析。,1. 放射免疫技术,62,放射免疫分析基本原理,竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力,63,放射免疫测定法(RIA)示意图,64,将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体，制成荧光抗体诊断试剂。用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断抗原的存在、定位和分布情况。免疫荧光技术有直接法和间接法等。,2.免疫荧光技术,65,免疫荧光技术直接法,66,免疫荧光技术间接法,67,免 疫 荧 光 染 色 显 示 细 胞 骨 架,免疫荧光染色是利用抗原抗体特异性结合的原理，用经荧光染料标记的抗体对细胞或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对特定的蛋白质进行细胞或组织内的精确定位。,常用于抗原、抗体标记的荧光染料有以下几种：显示绿色荧光：Fluorescein isothocyancie(FITC),Alexa-488显示红色荧光：Rhodamine B（罗丹明）, Texas Red, Alexa-546,568,594显示蓝色荧光：Alexa350,68,3、免疫酶技术, 灵敏度高，可与放射免疫相比，检测能力可达ng水平。 应用范围广，既能检测抗体又能检测抗原，既能定性又能定量、定位。 不需要特殊设备，放射免疫需要特殊的实验室条件，免疫荧光法需要荧光显微镜。酶标记物有效时间较长，一般低温保存可达一年以上。,69, 活性高，分解底物的能力强。 特异性强，即作用于底物的专一性强。 与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。 与底物作用可以显色。 纯度高、易纯化。 可溶性(水溶性)好，在溶液中稳定。 测定方法简单。 来源广、价格低。,标记酶的选择条件：,70,以HRP最为常用，具有活力高、稳定、分子量小、易提纯等优点。,致癌,分子量40kD82186,71,72,酶联免疫吸附试验Enzyme linked immunosorbent assay,简称：ELISA1971年Engvall和Perlmann发表是一类在固相载体上进行免疫酶染色的免疫酶标记技术,73,1）基本原理与类型,一种固相免疫测定技术，先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。,74,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。,75, 双抗体夹心法测抗原 检测抗原最常用的方法,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。,76, 双抗原夹心法测抗体,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。,77, 间接法测抗体 检测抗体最常用的方法,间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应抗体的方法。,酶标抗体,血清样品,底物,终止液,78,竞争法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。,竞争法,79,用已知特异性抗体包被固相载体,测定孔加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合,对照孔只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合,分别洗涤除去未结合的成分,加底物显色,分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量,80, 捕获包被法测IgM抗体,IgM的检测常用于传染病的诊断，尤其用于病毒性感染的早期诊断。,血清样品或参比品,酶标抗体,特异性抗原,底物,终止液,抗人IgM抗体连接在固相载体形成固相抗人IgM,加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在（阳性反应）,81, ABS-ELISA法（亲和素-生物素系统-酶联免疫吸附试验）,：固相支持物； ：样品； ：特异性IgG；：生物素化抗小鼠IgG 抗体（Biotin）；：HRP酶标链亲和素（Avidin）；：DAB显色液；：显色；,ABS：亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system）,82,2）ELISA的一般操作方法,83,84,85,86,87,共同特点：象搭积木一样在固相载体上一层一层叠加,88,89,90,91,92,第三节 细胞免疫技术,一、细胞分离原理1、基于细胞的物理特性 1）细胞比重差异 2）细胞的粘附性 3）细胞对渗透压改变的敏感性2、基于细胞表面的特异性标志物 1）免疫磁珠分离法 2）流式细胞术,93,3、血液细胞的组成及比重,外周血,红细胞,粒细胞,单个核细胞,血小板,单核细胞,1.093,1.0301.035,1.0751.090,(PBMC),1.092,94,原理：外周血各种血细胞的比重不同，利用淋巴细胞分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。,一）单个核细胞分离-密度梯度离心法,二、细胞分离方法,95,Ficoll：1.0770.001 Percoll常用密度 20% 1.031 30% 1.043 40% 1.056 50% 1.067 60% 1.077 70% 1.090,细胞比重,分层液比重,96,离心后,PBMC,红细胞粒细胞,Ficoll/60% Percoll,稀释外周血,稀释的血浆、血小板,Ficoll/60% Percoll,97,1、粘附去除法,原理：单核细胞和粒细胞在37和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。方法：1）玻璃器皿吸附法 2） 玻璃纤维柱法,二）淋巴细胞分离,98,2、改变细胞密度法,原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。方法：磁铁吸引法和羟基铁-乳胶分层液法,99,三）T、B、NK细胞的分离,T细胞：E花环分离T细胞B细胞：尼龙纤维分离B细胞（对尼龙纤维特有的吸附能力）免疫磁珠分离法与流式细胞术（淋巴细胞表面的标志差异）,100,流式细胞术,概念:流式细胞仪 (flow cytometer, FCM)：是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术 (flow cytometry)：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。又称荧光激活细胞分选仪分离法（FACS）,101,机型,1. 分析型流式细胞仪： 检测标记细胞的百分比含量。 同时检测四色不同染色的细胞。2. 分选型流式细胞仪： 无菌获取阳性细胞，以进一步培养。 同时获取四色不同染色的细胞。,流式细胞术可以同时鉴别单个细胞上的多种抗原，而且可以在极短时间内分析大量细胞。,102,流式细胞仪的工作原理,光学系统 激光光源 光收集系统液流系统 流动室 液流驱动系统电子系统 光电转换 数据处理系统细胞分选系统,103,操作方法,1. 将分离的单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1107 /ml；2. 加适量荧光单抗（NK细胞特异性的抗原为CD16、CD56；T细胞CD3），4孵育30min，用RPMI-1640培养基洗2次；3. 用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。,104,特点,1、各种组织细胞均可用于分析，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等，实体组织经处理后制成单细胞悬液均能分析。2、测量速度快，每分钟能测量数千至数万个细胞。3、可进行多参数的分析，可同时检测四种不同荧光染色的细胞。新一代的流式可同时检测十多色的细胞。4、可将目的细胞无菌分选出来做进一步的培养。,105,三、淋巴细胞的功能检测,淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。,106,(一) T细胞功能的检测,T细胞增殖试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验,107,1、T淋巴细胞增殖试验,1）原理：,T淋巴细胞,DNA合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,108,2）淋巴细胞转化的刺激物,非特异性刺激物： PHA -T细胞 ConA -T细胞 PWM -T、 B细胞 LPS -B细胞特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原,109,3）检测方法,形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天） 母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞 DNA合成期 + 3H-TdR掺入 收集细胞 检测射线,测定细胞内的3HTdR,110,形态学检查法,111,原理：活细胞内线粒体脱氢酶能将噻唑盐（MTT）由黄色转变为蓝紫色的甲臜，甲臜的形成量与细胞增殖程度有关，与活细胞数成正比。甲臜溶于有机溶剂（DMSO、乙醇等）后，可在560nm波长下用酶标仪检测。MTT法简单快速、准确，广泛应用于疫苗免疫效果测定、新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。,MTT法,112,MTT,测吸光度,113,实验步骤,）小鼠处死取脾脏或大动物采全血）分离淋巴细胞制细胞悬液 3）细胞计