生物化学与分子生物学第一章 蛋白质的结构与功能

Wang-Kai Fang, PhD（方王楷）Department of biochemistry and Molecular BiologyShantou University Medical College,Biochemistry生物化学,绪 论,什么是生物化学？,就是研究生命化学的科学，它运用化学原理和方法从分子水平探讨生命现象的本质,研究方法：,主要采用化学的原理和方法，同时也与生理学、细胞学、遗传学相联系和交叉,研究内容,一、生物分子的结构与功能：探讨生物体的物质组成以及分子结构、性质和功能二、物质代谢及其调节：物质代谢的规律、能量转化及其调节控制 属静态生化三、基因信息传递规律及其调控：DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译、基因表达调控等通常将生物大分子结构、功能及其代谢调控的研究称为分子生物学（生物大分子的来龙去脉） 属动态生化,生物化学的发展简史,起始阶段（18世纪-20世纪初）：研究了脂类、糖类及氨基酸；发现了核酸；酵母发酵中的“可溶性催化剂”-酶的概念等快速发展阶段（20世纪初-下叶）：必需氨基酸、维生素的发现；酶的蛋白质本质揭示；多种激素的发现；主要物质代谢途径的确定等分子生物学的崛起阶段（20世纪下叶-）：,分子生物学的重要事件,50年代：蛋白质-螺旋结构的发现； 53年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型-分子生物学的里程碑；中心法则的提出；遗传密码的破译 70年代：DNA重组技术(基因工程)、基因诊断、基因治疗的发展 80年代：核酶（ribozyme）、PCR技术等 90年代-：人类基因组计划（约3.0109碱基、2-3万个基因）、后基因组时代（蛋白质组学、生物信息学）,生物化学-一门新兴的边缘学科,是医学的主要基础课程之一（“三理一化”）,交叉渗透到医学各学科,与临床医、药学关系密切,发展为分子免疫学、分子遗传学、分子病理学、分子药理学等新学科,研究热点：疾病相关基因克隆、基因诊断、基因治疗,第一篇生物大分子的结构与功能,一、蛋白质 （protein）二、核酸（nuclear acids）三、酶 （enzyme）,第 一 章蛋白质的结构和功能,Structure and Function of Protein,第一节 蛋白质的化学组成,第二节 蛋白质的分子结构,第三节 蛋白质结构与功能的关系,第四节 蛋白质的理化性质、分离、纯化,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。,二、蛋白质的生物学重要性,1. 蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,Proteins make up all living materials,1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递,2. 蛋白质具有重要的生物学功能,碳(C) 50%-55%,氢(H) 6%-8%,氧(O) 19%-24%,氮(N) 13%-19%,16%；N(g)6.25= 样品Pro含量,硫(S) 0%-4%,少量的 P、Fe、Cu、Zn、I,第一节 蛋白质的化学组成,元素组成,蛋白质元素组成的特点：,一、氨基酸(amino acid) 蛋白质的构件分子（building blocks）,Amino group,Carboxylic group,氨基酸结构通式,R group,氨基酸的种类,1809年发现Asp，1938年发Thr，目前已发现300多种构成蛋白质的20种氨基酸的结构特点： 1.均为L-氨基酸，各种aa的R侧链各不相同 2.-碳原子上均连有一个氨基(脯氨酸除外) 3.-碳原子为手性碳原子(甘氨酸除外）,脯氨酸属于L-亚氨基酸，而甘氨酸则属于-氨基酸,丙氨酸的两种立体异构体,构型：分子中各原子或基团之间的连接方式称为分子的构型。组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。,（一）氨基酸的分类,根据氨基酸侧链基团的结构和理化性质，分为4类：,1.非极性疏水性氨基酸,2.极性中性氨基酸,3.酸性氨基酸,4.碱性氨基酸,1） 7个非极性疏水性氨基酸,甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）,2） 8个极性中性氨基酸,R-基含有极性基团；生理pH条件下不解离, 即不带电荷,酪氨酸(Tyr),色氨酸(Trp),丝氨酸(Ser),半胱氨酸(Cys),蛋氨酸(Met),天冬酰胺(Asn),谷氨酰胺(Gln),苏氨酸(Thr),极性最强,4） 3个碱性氨基酸,R-基有NH2/NH3+；带正电荷,赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His),3） 2个酸性氨基酸,R-基有COOH/COO-；带负电荷,甘氨酸（Gly） 无光学活性,几种特殊氨基酸,脯氨酸 Pro （亚氨基酸）, 半胱氨酸 Cys,胱氨酸,苯丙氨酸Phe、酪氨酸Tyr 和色氨酸Trp,苯丙氨酸的max257nm酪氨酸的max275nm色氨酸的max280nm,氨基酸残基侧链修饰,有些氨基酸没有相应的遗传密码，而是在肽链从核糖体释放后经化学修饰形成的。如胶原蛋白中含有大量的羟脯氨酸和羟赖氨酸，分别是脯氨酸和赖氨酸经羟化而成的。有些蛋白质中的天冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸发生糖基化形成糖蛋白，丝氨酸磷酸化成为磷酸丝氨酸。,蛋白质共价修饰,蛋白质磷酸化,Phosphorylation is a highly effective means of regulating the activity of target proteins. 30% eukaryotic proteins are phosphorylated. Protein kinases: The enzymes that catalyze phosphorylation reactions. one of the largest protein families 100 in yeast 500 in human beings Kinases: specificitySer/Thr kinases: acceptor is -OH of Ser or Thr Tyr kinases: acceptor is -OH of Tyr Tyr kinases are unique to multicellular organisms, important in growth regulation. Tyr kinase mutations often occur in cancer cells,Protein Phosphorylation,Dephosphorylation,Phosphorylation,磷酸化使蛋白质带上强烈负电基团,Protein Glycosylation Common in Eukaryotic Proteins,N-连接糖蛋白的糖基化位点为Asn-X-Ser/Thr,O-连接糖蛋白：糖蛋白糖链与蛋白部分的丝/苏氨酸残基的羟基相连,（二） 氨基酸的理化性质,pH pI,pH = pI,1. 氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,阳离子,阴离子,氨基酸的兼性离子,K1,K2,除碱性氨基酸外，其余氨基酸等电点均小于7,pI=1/2（pK1+pK2）,若一个aa有3个解离基因，则其pI为兼性离子两边pK的平均值,等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,氨基酸的解离常数可通过测定滴定曲线求得,2.紫外吸收性质,色氨酸和酪氨酸在280nm波长附近对紫外光有最大吸收峰,据此可以通过测定蛋白质溶液280nm的吸光值快速测定其蛋白质含量,3.茚三酮反应,aa与水合茚三酮一起加热，生成蓝紫色的化合物，在570nm处有最大吸收。据此亦可用作aa含量分析,（一） 肽与肽键,二、肽,一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱去一分子水缩合形成的键称肽键(peptide bond),+,丙氨酸,苯丙氨酸,二肽,丙苯氨丙氨酸,肽peptide,氨基酸借肽键相连而形成的化合物,寡肽(oligopeptide ):10个以内氨基酸连成,多肽(polypeptide )：多个氨基酸连成的肽，其形 状为一条没有分支的长链，又称多肽链或肽链,氨基端(端),羧基端(C端),氨基酸在形成肽链时失去了一分子水，肽链中的氨基酸分子不再完整，称为氨基酸残基(amino acid residue),氨基酸残基,蛋白质与多肽的区别：,Protein,空间构象相对稳定,氨基酸残基数较多,Peptide,空间构象不稳定,氨基酸残基数较少,（二）生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione，GSH),构成第一个肽键的羧基是谷氨酸的r羧基,半胱氨酸(Cys),甘氨酸(Gly),谷氨酸(Glu),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,GSH上的氢，在谷胱甘肽过氧化物酶的催化下，能还原细胞内产生的H2O2，使其变成H2O，同时GSH成为氧化型即GSSG，后者又在谷胱甘肽还原酶催化下，再生成GSH。因此，GSH是细胞内十分重要的还原剂。,种类较多，生理功能各异。多肽类激素主要见于垂体及下丘脑分泌的激素，如催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（3肽）。 神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（5肽）、-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等。,2. 多肽类激素及神经肽,由下丘脑分泌，其功能是促进腺垂体释放促甲状腺素(调节糖代谢),促甲状腺素释放激素,(1) 组成,(2) 功能,三、蛋白质的分类,1. 根据组成成分分为：,单纯蛋白质全部由aa组成,结合蛋白质除蛋白部分外，还含非蛋 白部分,结合蛋白质中的非蛋白部分称为辅基，常以 共价键与蛋白部分相连,辅基：包括色素、寡糖、脂类、磷酸、金属 离子乃至核酸等,2. 根据其形状分为：,纤维蛋白质分子状如纤维，其长轴 比纵轴大于10：1,球状蛋白质分子状如球形或椭圆形,结构蛋白质，难溶于水，常作为细胞支架和细胞连接，如大量存在于结缔组织中的胶原蛋白,可溶于水，如:酶、转运蛋白、蛋白质类激素及免疫球蛋白等,3. 根据其结构特点进行分类：,蛋白质的特定结构域（domain）或模体（motif）常与某种生物学功能相联系,将具有相同或类似结构域或模体的蛋白质归类，分别称为超家族（superfamily）、家族（family）或亚家族（subfamily）,居于同一类别中的蛋白质/多肽同源性越高，即相似的结构成分越多，功能越接近,第二节 蛋白质的分子结构,一级结构 (primary structure)二级结构 (secondary structure)三级结构 (tertiary structure)四级结构 (quaternary structure),空间结构,一、蛋白质的一级结构,蛋白质一级结构的概念：蛋白质分子中所有氨基酸的排列顺序，主要化学键：肽键，二硫键氨基酸序列书写：以氨基端开始,羧基末端结束依次编1、2、3,蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序称为蛋白质的一级结构,胰岛素的一级结构,蛋白质的一级结构是其空间构象和特异生物学功能的基础，一级结构决定高级结构，但不是唯一因素,牛胰核糖核酸酶的一级结构,二、蛋白质二级结构,概念：是指蛋白质分子中一段多肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及到aa侧链R基团的构象肽单元（肽平面）：肽键的6个原子C1 、C、N、O、H、 C 2位于同一平面，构成所谓的肽单元,肽键中，与-相连的O和H呈反式构型,（反式）,（顺式）,肽键的特点：,C-N单键为0.149nm,C=N双键为0.127nm,具有部分双键性质,不能自由旋转,肽键中键长为0.132nm,肽键为共价键，具有部分双键性质，不能自由旋转。参与肽键组成的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元（酰氨平面） 。,多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以碳原子相隔。,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),主要的化学键：氢键,蛋白质二级结构是以一级结构为基础，其形成受氨基酸残基侧链的影响。,（一） -螺旋 (- helix),由肽键平面盘旋形成的螺旋状构象,2. -螺旋的结构特征,以肽键平面为单位,以-碳原子为转折盘旋形成右手螺旋,(2) 每3.6个氨基酸残基 绕成一个螺圈(3600),螺距为0.54nm,每个氨基酸上升0.15nm,肽键平面与中心轴平行,(3)主链原子构成螺旋的主体,侧链在其外部,(4)每个肽键的N-H和第四个肽键C-O都形成氢键,是稳定螺旋的主要作用力,氢键的方向与中心轴大致平行,Ala, Glu, Leu和Met比Gly，Pro，Ser和Tyr更常见；Pro的氮原子不能形成氢键,（二）-折叠 (-pleated sheet),肽键平面呈伸展的锯齿状排列,形成的结构称-折叠。常为两条或两条以上伸展的多肽链侧向聚集在一起形成扇面状，故又称-折叠片或-片层,1.概念,多肽链主链走向呈折纸状，而氨基酸侧链基团交替地位于折纸状结构上下方。在两条相邻的肽链或一条肽链内的若干肽段之间形成氢键。,2. -折叠结构特点,(1) 相邻肽键平面的夹角为1100 ，呈锯齿状排列;侧链基团交错地分布在片层平面的两侧,()由氢键维持稳定。其方向与折叠的长轴 接近垂直,()条肽段平行排列构成，肽段之间 可顺向平行(均从N-C)，也可反向平行,（三）-转角(-turn),肽链出现1800回折的转角处结构称为-转角,1.概念,2.结构特征,第一个残基的C=O与第四个残基的N-H形成氢键 第二个残基常为脯氨酸,* 常见于球状蛋白质分子表面,（四）无规卷曲(random coil),1.概念,没有确定规律性的肽键构象,常见于球状蛋白质分子中，在其它类型二级结构肽段之间起活节作用，有利于整条肽链盘曲折叠,超二级结构(模体motif),由几个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近、相互作用，所形成的折叠模样.,* 类型,* 概念, 、, ,、 ,相互作用主要由非极性氨基酸残基参与,锌指结构,由一个-螺旋和两个反平行的-折叠三个肽段组成。形似手指，具有结合锌离子的功能。,三、蛋白质的三级结构,疏水键（最主要）、离子键、氢键和范德华力等。,主要的化学键:,定义: 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即多肽链的整体构象。,维系蛋白质结构的作用力,1. 肽键,共价键,2. 二硫键,共价键,3. 次级键,非共价键,维系蛋白质空间结构,维系蛋白质一级结构,次级键的种类：,氢键、疏水相互作用、离子键和范德华力,氢键,负电性很强的原子（如氧或氮）和与氧或氮共价结合的氢原子相互吸引，这种作用力称为氢键。,疏水相互作用,由非极性基团受到水分子排斥相互聚集在一起的作用力,离子键,由异性电荷间的静电吸引形成的键,侧链基团之间形的 氢 键、离子键、疏水作用、分子引力、二硫键,疏水核：疏水区从位于分子内部，往往是与辅酶/基或底物结合位点,维持蛋白质三级结构稳定的因素,亲水区：亲水区多位于分子表面，故球形蛋白质水溶性较好,蛋白质三级结构的意义：,蛋白质的三级结构决定了蛋白质的生物学功能,1963年Kendrew等通过鲸肌红蛋白的x-射线衍射分析，测得了它的空间结构。,肌红蛋白 (Mb),Mb是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段-螺旋结构。整条多肽链折叠成紧密球形分子，氨基酸侧链上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电荷的则在分子表面。Mb分子内部有一个袋形空穴，血红素居与其中。血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。,视紫红质,分子伴侣参与蛋白质的折叠,分子伴侣是细胞中一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。,封闭待折叠蛋白暴露的疏水区段，创建一个隔离的环境，促进折叠与去聚集,（1）核糖体结核性分子伴侣，包括触发因子和新生链相关复合物； （2）非核糖体结合性分子伴侣，包括热激蛋白、伴侣蛋白等。,热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用：结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。,热休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和GrpE族,HSP40结合待折叠多肽片段,HSP70-ATP复合物,HSP40- HSP70-ADP-多肽复合物,ATP水解,GrpE,ATP,ADP,复合物解离，释出多肽链片段进行正确折叠,HSP70反应循环,伴侣蛋白的主要作用:为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,伴侣蛋白(chaperonins) GroEL和GroES家族,GroEL and GroEs pathway in E. coli,non-folded peptide,folded peptide,GroEL,GroES,14亚基,7亚基,ATP,ADP,ATP,ADP,通过消除不正确折叠，增加功能性蛋白折叠产率，不改变折叠反应速度,四、蛋白质的四级结构,对蛋白质分子的二、三级结构而言，只涉及一条多肽链卷曲而成的蛋白质。而有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，其中每一个具有独立三级结构的多肽链称为蛋白质的亚基 。蛋白质分子中各亚基之间的相对空间位置，称为蛋白质的四级结构。由一条肽链形成的蛋白质没有四级结构。主要的化学键主要是疏水键、氢键和离子键。,血红蛋白的四级结构,血红蛋白：具有个亚基组成的四级结构，可结合分子氧。成人由两条-肽链和两条-肽链组成,Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.195,第三节 蛋白质结构与功能的关系,（一） 一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,以124个氨基酸残基组成的牛胰核糖核酸酶（4对二硫键）为例说明,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,牛胰核糖核酸酶的变性与复性,空间构象遭破坏的蛋白质，只要一级结构未被破坏，即可能回复到原来的高级结构,蛋白质的功能与其空间构象密切相关,一级结构相似的蛋白质高级结构及功能相似一级结构不同的蛋白质高级结构及功能不同,胰岛素的一级结构及种属差异,（二）一级结构与功能的关系,ACTH 促肾上腺素皮质激素,MSH 促黑激素,两者均可促进皮下黑色素生成,氨基酸序列提供重要的生物进化信息,物种越相近，细胞色素C的一级结构越相似，其空间构象和功能也相似,镰刀状红细胞贫血,N-val his leu thr pro glu glu C(146),HbS 肽链,HbA 肽 链,N-val his leu thr pro val glu C(146),正常人血红蛋白链的第6位氨基酸是Glu，而镰刀状细胞贫血病人的血红蛋白中， Glu变成了Val，仅此一个氨基酸之差，本是水溶性的血红蛋白，就聚集成不溶性的纤维束，并引起红细胞变形成镰刀状而极易破裂，产生贫血。这种由蛋白质分子一级结构发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,重要蛋白质氨基酸序列的改变可引起疾病,HbA -链：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS -链：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,HbA（ adult hemoglobin） HbS（sickle-cell hemoglobin）,二、蛋白质空间结构与功能的关系,（一）肌红蛋白Mb与血红蛋白Hb,蛋白质的空间结构决定生物学功能,肌红蛋白（1个亚基）与血红蛋白（4个亚基）虽然一级结构有较大差异，但均具有与氧可逆地结合的能力,其结构特点是，都与血红素（辅基）共价结合,肌红蛋白和血红蛋白是两个研究得最透彻的蛋白质，它们是蛋白质结构与功能的范例。肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质，它和血红蛋白的亚基在空间构象和功能上十分相似。,肌红蛋白,Mb是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段-螺旋结构。易与氧气结合，氧解离曲线呈直角双曲线。整条多肽链折叠成紧密球形分子，氨基酸侧链上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电荷的则在分子表面。Mb分子内部有一个袋形空穴，血红素居与其中。血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。,血红蛋白,血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基中间有一个疏水袋形空穴，可结合一个血红素并携带1分子氧， 因此1分子Hb共结合4分子氧。Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似。Hb各亚基之间通过8对盐健，紧密结合成亲水的球状蛋白。成人红细胞中Hb主要是由两条肽链和两条肽链组成（22）。,血红蛋白在氧分压较低时，与氧气结合较难，氧解离曲线呈状曲线。 但当氧与血红蛋白分子中一个亚基的血红素辅基的铁结合后，即引起该亚基构象的改变，一个亚基构象的改变又会引起其余亚基的构象相继发生改变，亚基间的次级键被破坏，结果整个分子从紧密的构象变成比较松散的构象，易于与氧结合，从而使血红蛋白与氧结合的速度大大加快。,（二）血红蛋白的构象变化与结合氧,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,氧饱和度,静脉血,动脉血,氧分压,P50,100% -,Hb,Mb,Mb易与O2结合，而Hb在O2分压较低时较难结合O2 Hb氧解离曲线为S状曲线，而Mb的为双曲线。因为： Hb第一个亚基与氧气结合以后，促进第二及第三个亚基与氧气的结合，当前三个亚基与氧气结合后，又大大促进第四个亚基与氧气结合。即Hb各亚基间存在正协同效应。,特点：,血红蛋白中血红素辅基的结构,铁卟啉化合物，由4个吡咯环通过4个甲炔基相连成为环形,Fe2+有6个配位键，其中4个与吡咯环的N配位结合，一个与组氨酸残基结合，一个结合氧,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,氧合作用显著改变Hb的四级结构，血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换（从T态R态）,T态（tense state）紧张态,R态（relaxed state）松驰态。,变构效应 (allosteric effect)蛋白质因与小分子物质相互作用而发生空间结构的改变，导致蛋白质功能的变化，称为变构效应。,* 协同效应 (cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 如果是抑制作用则称为负协同效应,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。,这类疾病包括： 疯牛病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈病等。,疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一种人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,PrPsc对蛋白酶不敏感，水溶性差，对热稳定，可以互相聚集，形成淀粉样纤维沉淀而致病,第四节 蛋白质的理化性质、分离纯化,一 、蛋白质的理化性质,（一）两性解离和等电点,蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的pH值,+OH-,+H+,+OH-,+H+,pH=pI,pHpI,* 蛋白质的等电点 ( pI ) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质除两端的氨基和羧基可以解离外，氨基酸残基侧链的某些基团，如谷氨酸、天冬氨酸残基中的羧基，赖氨酸残基中的氨基，精氨酸残基的胍基和组氨酸残基的咪唑基，在一定溶液pH条件下都可以解离成带负电荷或正电荷的基团。大多数蛋白等电点接近pH5.0，带负电荷；少数蛋白含碱性氨基酸较多，等电点偏碱性，被称为碱性蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等。少数等电点偏酸性，被称为酸性蛋白质，如胃蛋白酶和丝蛋白。,蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间,属胶体颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体,蛋白质的胶体原因：,表面形成水化层,表面同种电荷的斥力,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围,蛋白质在非等电点时带有同种电荷,蛋白质的聚沉,（三）蛋白质的变性、沉淀与凝固,变性后的蛋白称为变性蛋白质,1. 蛋白质的变性作用,在某些理化因素作用下.蛋白质的构象被破坏，失去其原有的性质和生物活性，称为蛋白质的变性作用(denaturation),概念:,造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂、超声波、紫外线、震荡等。,变性的本质,主要为二硫键和非共价键的破坏，不涉及一级结构的改变。变性后，其溶解度降低，粘度增加，结晶能力消失，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,除去变性因素后，有的变性蛋白质又可恢复其天然构象和生物活性，这一现象称为蛋白质的复性,蛋白质的复性(renaturation),* 蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，溶解度降低，甚至肽链相互聚集，而从溶液中析出的现象。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,盐析法：加入大量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠或氯化钠 ），脱去水化层而沉淀。,有机溶剂沉淀法：加入极性的有机溶剂如乙醇、丙酮等，破坏水化层而沉淀。,重金属盐沉淀法：当pH大于等电点时，蛋白质颗粒带净负电荷，易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。,生物碱或酸类沉淀法：当pH小于等电点时，蛋白质颗粒带净正电荷，易与生物碱或酸根负离子结合成不溶性盐而沉淀。,加热变性沉淀法：蛋白质因加热变性而凝固。,蛋白质沉淀法,（四）蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,（五）蛋白质的呈色反应, 茚三酮反应蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。, 双缩脲反应 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应。双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,二、蛋白质的分离和纯化,蛋白质分离纯化方法,吸附：吸附层析,特异亲和力：亲和层析,其它：如高效液相层析（HPLC）,（一）透析及超滤法,* 透析 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离。,* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜（半透膜） ，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*盐析是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,* 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,（三）蛋白质电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳 (elctrophoresis) 。,几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,（四）层析,层析分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,带正电荷多蛋白紧密结合,带负电荷多蛋白流过层析柱,阳离子交换树脂工作示意图,分子筛层析,亲和层析工作示意图,蛋白质,载体介质,配体,结合,洗脱,洗脱介质,(六)超速离心,三、多肽链中氨基酸的顺序分析,第一步： 分离提纯蛋白质 ，测定NH2末端的数目，确定蛋白质分子是 由几条肽链构成的，并分离出 每条肽链。测定肽链的分子量,计算组成该肽链的氨基酸残基数及每种aa的百分组成。,一般过程：,肽链分子中氨基酸残基数=肽链的分子量120 （各种的氨基酸残基的平均分子量为120）,再将肽链彻底水解，用离子交换层析法将各种的氨基酸分离。,a.丹磺酰氯法 丹磺酰氯是一种强荧光剂，它能专一地与链N-端-氨基反应生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定出N-端是何种氨基酸。,第二步 测定肽链的氨基末端和羧基末端,1.N末端的测定,b.二硝基苯氟法 ：过时,2.C末端的测定,常用羧基肽酶法,羧基肽酶专一地将肽链水解成片断，分别进行顺序分析,第三步 肽链的局部水解,胰蛋白酶的作用原理,1. 酶解法,CNBr与Met反应测定Pr的一级结构,2.化学法,层析鉴定就可N-端开始确定被测肽段的氨基酸排列顺序,第四步 肽段氨基酸顺序分析,一般采用 Edman降解法,弱碱条件,异硫氰酸苯酯,+,N端-氨基,苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽）,酸性条件,环化,水解,苯乙内酰硫氨基酸(PTH-aa),失去原N-端氨基酸的肽,剩下的肽可反复进行上述处理，依次生成各种PTH-aa，,Edman降解法的示意图,一般常用多种方法使肽链断裂，并分析出各肽段中的氨基酸顺序。由于在不同部位断链，只要找出多套肽段的重叠部位，然后组合排列对比，即可推断肽段的排列顺序，从而得出完整肽链中氨基酸的顺序,第五步 肽链一级结构的确定,则其氨基酸排列顺序为：Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys,如测一个九肽,测得N端氨基酸残基为Thr,又分别测得片段: Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Val-Lys-Ala-Ala-TrpThr-Asn-Val-Lys,另外，亦可以通过基因中核苷酸顺序推测蛋白质的氨基酸顺序,四、蛋白质空间结构的测定,1. X射线晶体衍射法,X-衍射图代表射线穿过（蛋白质）晶体的一系列平行剖面的各原子的电子密度，然后再借助计算机绘制出三维的电子密度图,2.二维磁共振技术,3. 蛋白质空间结构的预测,（1）根据分子力学、分子动力学、物理化学原理，从理论上计算推测蛋白质的空间结构,（2）从已知蛋白空间结构规律，从一级结构推测空间结构,血浆蛋白,是血浆中的蛋白质，是血液中除了血红蛋白以外的蛋白质。,维持血浆的胶体渗透压平衡：由血浆清蛋白所决定的，清蛋白分子量较小（69kD），带负电荷量多，总含量大，浓度高，吸引水分子聚集在其表面，起到维持胶体渗透压的作用。维持血浆的pH值稳定：与血浆蛋白电离后形成蛋白质盐。运输作用：前清蛋白（视黄醇）、脂蛋白（运输脂类）、结合珠蛋白（运输血红蛋白）、转铁蛋白（运输铁）、血清铜蓝蛋白（铜）等。免疫作用：血浆中含有许多种免疫球蛋白，可识别结合形成抗原-抗体复合物，激活补体系统。催化作用：主要与血浆中的由蛋白质构成的酶有关。营养作用：血浆中的蛋白质还可以参与构成组织蛋白质。凝血、抗凝血和纤溶作用：血浆中的凝血因子参与