遗传标记技术及应用

遗传标记技术及应用,夏海武,一、遗传标记的发展,1、形态学标记2、细胞遗传标记3、生化与免疫遗传标记4、分子遗传标记5、理想的分子遗传标记应具备的特点,1、形态学标记,形态学标记(morphological marker)能够用肉眼识别和观察、明确显示遗传多样性的外观性状。特点简单直观，但标记数目少，多态性低，易受外界条件的影响；依据它进行选择的准确性差，所需时间较长，选择效率也较低。,古代形态学标记,公元前4000年，伊拉克的古代巴比伦石刻上记载了马头部性状在个世代的遗传。,伯乐相马,按图索骥,2、细胞遗传标记,细胞遗传标记(cytological genetic marker)主要是指染色体核型（染色体数目、大小、随体、着丝粒位置、核仁组织区等）、带型（Q、G、C、R带型）和数量特征的变异等，它们分别反映了染色体在结构上和数量上的遗传多态性。,人类染色体核型,家猪X、Y染色体G带示意图,细胞遗传标记的特点,不易受环境影响，呈孟德尔方式遗传。多态性集中表现在染色体高度重复DNA结构的异染色质所在的部位。细胞遗传标记经常伴有对生物有害的表型效应，难以获得相应的标记材料，或者观测和鉴定比较困难，从而限制了细胞遗传标记的应用。,3、生化与免疫遗传标记,免疫遗传学标记(immunogenetical marker)以动物的免疫学特性为标记，包括红细胞抗原多态性和白细胞抗原多态性。生化遗传标记(biochemical genetic marker)主要是指在同一动物个体中具有相同功能的蛋白质存在两种以上的变异体。,同工酶与等位酶,同工酶(isozyme)：电泳所可区分的同一种酶（系统）的不同变化等位酶(allozyme)：由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同,等位酶分析的过程,材料的采集,研磨和酶的提取,酶的保存,凝胶制备,电泳,凝胶切片,酶的组织化学染色,酶谱的记录与分析,数据分析,生化与免疫遗传标记的特点,与形态学标识和细胞遗传标记相比，数量更丰富，受环境影响更小，检测手段简便，是一种较好的遗传标记。血液型和蛋白质型都是基因表达的产物，局限于反映基因组编码区的遗传信息，且标记的数量还比较有限，不能很好地覆盖整个基因组。,4、分子遗传标记,分子遗传标记(molecular genetic marker)是一种新的以DNA多态性为基础的遗传标记.随着分子生物学的发展，相继建立了RFLP、RAPD、AFLP、SNP等多种分子遗传标记检测技术，开创了遗传标记研究的新阶段。,分子遗传标记的特点,分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。分子标记的优越性表现为：（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。,分子标记类型,目前的分子标记有三类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括RFLP、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）、原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、简单序列重复标记SSR或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）、扩展片段长度多态性标记AFLP、序标签STS、序列特征化扩增区域SCAR等；第三类是基于基因芯片等的一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等。,5、理想的分子遗传标记应具备的特点,遗传多态性高;检测手段简单快捷，易于实现自动化;遗传共显性，即在分离群中能够分离出等位基因的3种基因型。标记遍布整个基因组； 准确性高，能正确反映动植物的真实遗传，即标记是经济性状基因，或是与影响重要性的性状连锁。 实验重复性好（便于数据交换）； 开发成本和使用成本尽量低廉；,二、分子遗传标记,（一）基于分子杂交的分子标记（如：RFLP：限制性片段长度多态性 等）（二）基于PCR 技术的分子标记（如：随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, RAPD 等） （三）基于基因芯片等的分子标记（如：SNP：单核苷酸多态性 等）,（一）基于分子杂交的分子标记,这类标记利用限制性内切酶酶切不同生物体的DNA分子，然后用特异探针进行Southern杂交，通过放射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA的多态性。1、限制性片段长度多态性 （RFLP）restriction fragment length polymorphism最早应用于动植物遗传学研究的分子标记技术,RFLP的原理,利用限制性内切酶消化基因组DNA，形成大小不等、数量不同的分子片段，经电泳分离，通过Southern印迹将DNA片段转移至支持膜 (尼龙膜或硝酸纤维素膜)上，然后用放射性同位素(32P)或非同位素 (如地高辛，荧光素)标记的探针与支持膜上的DNA片段进行杂交。不同基因组DNA酶切位点的改变，会使得RFLP谱带表现出不同程度的多态性。,RFLP示意图,限制性片段的制备,电泳,Southern 印 迹,与放射性探针杂交,放射性自显影,RFLP的特点：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。,对分子标记中共显性的理解,（二）基于PCR 技术的分子标记,PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异性结合，按照引物类型可分为：单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，如：随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, RAPD）等技术；双引物选择性扩增的PCR标记，主要通过引物3端碱基的变化获得多态性，这种标记主要是扩增片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphisms, AFLP）；基于特异双引物PCR的标记，如简单系列重复标记（Simple sequence repeats, SSR）等。,1.RAPD（随机扩增多态性DNA）标记,Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技术一致。RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。,RAPD标记原理,（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性）不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。 RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键而艰巨的工作。只要实验条件标准化，可以提高RAPD标记的再现性。,RAPD标记的特点,2、AFLP（扩增片断长度多态性）标记,AFLP即扩增片段长度多态性，是1993年由Marc 和Pieter 发明创造的一种DNA分子标记。 该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及进行分类研究。,AFLP标记原理,对基因组DNA进行双酶切，在使用的两种限制性酶中，一种为酶切识别位点为4碱基的酶，另一种为识别位点为6碱基的酶。进一步将酶切片段和含有与其粘性末端相同的人工接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR反应的引物结合位点，通过选择在末端上分别添加13个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实现特异性扩增，最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。,AFLP标记的特点,（1）结合了RFLP稳定性和PCR技术高效性的特点，不需要事先知道DNA序列的信息，可以用于任何动植物基因组的研究。（2）多态性丰富。（3）标记多数具有共显性表达，无复等位效应，表现孟德尔方式遗传。（4）分析成本较高，对DNA的纯度和内切酶的质量要求也较高。,3、SSR（简单重复序列）标记,又称微卫星DNA(Micro-satellite DNA)标记；它是一类由1-6个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于基因组的不同位置。如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重复，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了万余个位点。,尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。,SSR标记的原理,微卫星分子标记对18份山羊草基因型的扩增结果,SSR标记的特点,（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；数量几乎无限。（2） SSR技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点。 （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子。（4）实验重复性好，结果可靠。（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。,（三）基于基因芯片等的分子标记1、 单核苷酸多态性（SNP）,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。检测 SNP 的最佳方法是DNA 芯片技术。SNP 被称为第三代DNA分子标记技术，随着 DNA 芯片技术的发展，其有望成为最重要最有效的分子标记技术。,SNP的特点：,SNP数量多，分布广泛。SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即双等位基因（biallelic）。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。SNP等位基因频率容易估计。易于基因分型。SNPs 的二态性，也有利于对其进行基因分型 。,三、DNA分子标记在植物生物技术中的应用,DNA分子标记是现代植物生物技术中应用的重要工具，其应用主要包括以下几个方面：,1、构建高密度的遗传连锁图 ： 在经典遗传学中由于遗传标记的数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。DNA分子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供了可能，促进DNA指纹的分析。,2、进行基因定位： 基因定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图的建立使目的基因的定位更为方便。,3、遗传多样性和物种亲缘关系： 分子图谱的构建和基因定位更加有利于遗传多样性和物种亲缘关系的研究。植物的遗传多样性是品种遗传改良的基础。 DNA标记可以覆盖整个基因组，能客观、准确地检测物基因组DNA水平的差异。,表1 96份大麦参试材料的编号及名称,表 多态性的SSR引物,图 96份大麦材料的SSR标记聚类图,图3 当K=4时基于模型的Strcture分析,4、种质鉴定和遗传背景分析： 利用DNA分子标记可以鉴别品种，评估品种纯度，分析农艺性状基因，分离和鉴别遗传材料，确定染色体同源性，对异源染色体和染色体结构畸变的检测。,5、育种中的分子标记辅助选择： 长期以来，植物育种都是依植株的表型性状进行选择的。DNA标记的出现使植物育种从表型选择过渡到分子育种的新阶段。分子标记辅助选择有许多显著的优点，主要体现在：可以清除同一座位不同等位基因间或不同座位间互作的干扰，消除环境的影响；在幼苗阶段就可以对在成熟期表达的性状进行鉴定，如果实性状、雄性不育等；