免疫学第四章 免疫球蛋白

第四章 免疫球蛋白,抗体的发现,灭活的白喉杆菌,免疫,动物,提取血清,中和作用的抗毒素,健康动物,注射,患有白喉杆菌的患者,提取,白喉杆菌,灭活,抵抗,1890年德国学者Behuing和日本学者北里,本章学习要点,第一节 概述 第二节 Ig的结构第三节 免疫球蛋白的分类 第四节 抗体的制备,第一节 概述,一、抗体（antibody, Ab）: Ab是B细胞识别抗原增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异地结合，具有免疫功能的球蛋白。,抗原,B细胞,浆细胞,识别抗原,增殖、分化,产生,与相应抗原特异性结合,抗体,二、免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig) 一般将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为Ig。免疫球蛋白的存在形式： 膜型（membrane immunoglobulin, mIg） - B细胞膜上的抗原受体； 分泌型(secreted immunoglobulin, sIg) -分泌进入体液, 介导体液免疫应答。,与Ag特异性 结合,发挥相应的作用,Ig（IgG、IgM、IgD、IgE/ IgA）,Ab,Ab=Ig,IgAb；Ab是功能描述，Ig是化学结构描述；,例如：骨髓瘤蛋白化学结构与抗体相似，但不具备抗体活性,三Ig与Ab的关系,抗体都是免疫球蛋白，而免疫球蛋白不都是抗体,Ig,Ab,四Ig 与 -球蛋白,用电泳法分析血清时，有抗体活性的Ig部分地存在于-区，因此常有将Ig与-球蛋白等同看待的现象。现已证明，抗体并不都在-区，而位于-区的也不是都具有抗体活性。,第二节、Ig的基本结构,一、免疫球蛋白的基本结构,免疫球蛋白分子是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。,（一）重链和轻链1、重链(简称H链) 由450-550个氨基酸组成，分子量约50-75KD。 H链含有少量糖类，所以Ig属于糖蛋白。 根据H链的抗原性不同，可将免疫球蛋白（Ig) 分为五类： IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE,H链抗原性因素：氨基酸组成种类和数量、排列顺序、二硫键的数目和位置,链,链,链,链,链,2、轻链(简称 L链) 由214个氨基酸组成，分子量约25KD 根据L链的抗原性不同，把L链分成二型： (kappa)型和(lambda)型,（二）、可变区和恒定区,可变区（简称V区） 位于L链靠近N端的1/2和H链的1/4，这个区段的氨基酸组成及排列顺序是可以变化的。高变区（ hypervariable region ）简称HVR ，是V区中氨基酸的组成和排列顺序变化频率更高的区域，也是抗体与抗原决定簇结合的部位，又称为决定簇互补区（CDR），又是Ig分子独特型决定簇主要存在的部位。骨架区（framework region,FR）： HVR区以外的部位，稳定V区的结构。,恒定区（简称C区），位于L链靠近C端的1/2和H链靠近C端的3/4区域，这一区域的氨基酸组成和排列顺序比较稳定，所以叫恒定区，H链和L链的恒定区分别称为CH和CL。,（三）、结构域（功能区）,1、Ig分子的H链和L链可通过链内二硫键折叠成若干个球形结构，每一个球形结构由110个氨基酸组成，具有一定的生理功能，称为功能区。 L链结构域：VL、CL H链结构域： IgG、IgA、IgD有4个：VH、CH1、CH2、CH3IgM，IgE：5个：VH、CH1、CH2、CH3、 CH4,2、各功能区的作用,L链可分为：VL、CL,H链可分为：VH、CH1、CH2、CH3、 （其中IgM、IgE还有CH4）,VL与VH：是结合抗原的部位。,CL、CH1：具有部分同种异型的遗传标志。,IgG的CH2和IgM 的CH3区是补体结合点，可激活补体经典途经。,补体,抗原,IgG的CH3和IgE的CH4区可与细胞膜表面相应的Fc受体结合。,（四）、铰链区,位于CH1 和CH2之间含有较多的脯氨酸，具有弹性，可以自由展开180度,抗体分子变构的特性可使V区合拢或张开，适合与抗原结合；暴露补体结合点，为补体活化创造条件。对蛋白酶敏感，经蛋白酶处理，多在此区被切断。,但IgE和IgM无铰链区,二、免疫球蛋白的其他成分,连接链（joining chain),简称J链，由浆细胞合成，连接5个单体IgM成五聚体，2个IgA成双聚体，故J链起稳定多聚体的作用。分泌片（secretory piece),简称SP,由上皮细胞合成，和分泌型IgA连接，使之不受环境中酶的破坏,并介导IgA的转运。,IgM,IgA,三、免疫球蛋白的水解片段 1. 经木瓜蛋白酶水解IgG 裂解部位：铰链区H链间的二硫键（近N端） 水解得到3个片段，2个相同的Fab段和1个Fc段 Fab段（fragment antigen binding)抗原结合片段, 每个Fab段由一条完整的L链和一条约1/2 的H链组成，具有抗体活性，能和抗原结合 Fc段(fragment crystallizable) 可结晶片段，由二条羧基端1/2H链组成，不能和抗原结合，但有Ig的其他活性。,2 .经胃蛋白酶水解IgG， 裂解部位：铰链区重链间二硫键近羧基端（C端） 水解 得到2个片段， F(ab,) 2和pFc F(ab,) 2具有双价抗体活性片段 pFc小分子多肽碎片，无任何生物活性,第三节 免疫球蛋白的分类,一、免疫球蛋白的类型,Ig根据其H-链抗原性的差异分为类、亚类，根据L-链差异分为型、亚型。在同一个体中可以存在各种类型、不同数量的Ig。,1.类：在同一种属所有个体内，根据重链C区抗原特异性的差异，将重链分为5类，即-链、-链、-链、-链、-链，相应的免疫球蛋白分别为IgG、IgM、IgA、IgD 和IgE。,IgG,IgM,IgA,IgD,IgE,2.亚类：同一类Ig，根据Ig重链抗原性以及二硫键的数目和位置不同，又可分为若干个亚类。IgG有 G1, G2, G3, G4四个亚类；IgA 有A1, A2两个亚类；IgM 有 2 个亚类： IgM1 和 IgM2,3.型：在同一种属所有个体内，根据Ig轻链C区抗原表位的差异，可将Ig轻链分为和，与此对应的Ig分为和型。4.亚型：同一型Ig中，根据轻链C区N端氨基酸排列的差异，又可将Ig分为亚型。1、 2 、 3、 4,二、免疫球蛋白的抗原性,双重特性： 抗体活性 免疫原性（抗原物质） 它之所以具有免疫原性是由于其分子中包含多种不同的抗原表位。免疫球蛋白分子上有三类不同的抗原表位，分别为：,同种型决定簇 同种异型决定簇 独特型决定簇,1同种型(isotype)：是存在于同种抗体分子中抗原表位，指同一种属所有个体Ig分子所共有的抗原特异性标志。同种型因种而异。同种型的抗原决定簇存在Ig的恒定区。,鼠的IgG,鼠的IgM,2同种异型(allotype)：是指同一种属不同个体间Ig分子所具有的不同抗原特异性。同种异型决定簇存在Ig的恒定区。由个体遗传基因所决定的，故称为遗传标记。,鼠的IgG1(品系A）,鼠的IgG1 (品系B）,3.独特型(idiotype)：是指在同一个体内，不同抗体形成细胞克隆所产生的Ig分子的V区具有不同的抗原特异性。独特型抗原决定簇存在Ig的V区，不同特异性的抗体其独特型也不同,鼠IgG1(抗A抗原）,鼠的IgG1(抗B抗原）,第四节 免疫球蛋白的生物学特性,Ig功能区,VH和VL是结合抗原的部位。CL和CH1为同种异型遗传标志所在的部位。IgG的CH2和IgM 的CH3区是补体结合点所在的部位，参与活化补体。IgG的CH3和IgE的CH4区能与组织细胞表面的Fc受体结合。,一、免疫球蛋白的生物学活性 Ig是多功能蛋白质，V区与Ag特异性结合，C区表达效应功能。,1.与Ag特异性结合2.激活补体,1,3.与Fc受体结合：Ig通过Fc端与多种细胞上的Fc受体结合，激发效应功能。 （1）调理吞噬作用：Ig可结合到吞噬细胞的Fc受体，促进M的吞噬颗粒性抗原。 （2）介导过敏反应：IgE的Fc端与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的FcR结合后，使细胞脱颗粒，释放生物活性物质，激发I型过敏反应。 （3）介导细胞毒作用：结合抗原的IgG与NK细胞的FcR结合，可激发NK细胞杀伤靶细胞的功能，成为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。,调理吞噬作用,介导过敏反应,介导细胞毒作用,参与ADCC,4.穿过胎盘和粘膜: IgG可借助其Fc端主动通过胎盘转移到胎儿，形成天然被动免疫。IgA可通过消化道和呼吸道的粘膜，是局部免疫的重要因素。,IgG是唯一能经胎盘输给胎儿的抗体,通过胎盘,5.免疫调节功能: Ig可通过独特性网络参与机体的免疫调节。,特异性结合抗原,中和作用,激活补体,溶解细胞,联合调理作用,ADCC作用,结合FcR,通过胎盘和粘膜,调理作用,通过胎盘,抗体的生物学作用,（一）IgG（单体）150KD 产生部位：淋巴结脾 1、分4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 2、血清中含量最高（75），分子量最小，在抗体介导的防卫机理中占主要地位 3、出生后3个月开始合成，35岁达成人水平 (8.017 mg/ml) ，半衰期最长(2123天) 4、唯一通过胎盘的Ig（新生儿抗感染） 5、丙种球蛋白的主要成分 6、抗感染抗体与自身免疫病及超敏反应 7、再次应答中的主要Ab,二、 各类免疫球蛋白的特性和功能,（二）IgM：单体或5个相同单体组成五聚体，单体结构与IgG相似。 五聚体IgM（1）分子量最大(900 kd)，又称巨球蛋白；存于血流内，抗败血症 （2）合成最早，半衰期短（5天- 血清中特异性IgM 水平增高提示有近期感染），用于早期诊断和产前诊断 （3）具有强大的调理作用，激活补体及杀菌作用（4）占血清Ig含量的510%（5）天然血型抗体主要为IgM （6）参与自身免疫及超敏反应（7）初次应答中的主要抗体,单体IgM 膜表面IgM（SmIgM）为B细胞最早出现的重要表面标志,（三）IgA: 产生部位：粘膜淋巴组织 （1）两种类型： 血清型 - IgA1(主要)，单体(主要)； 分泌型 - IgA2(主要)，二聚体(主要), （2）半衰期: 6天； （3）占血清Ig含量的5-15%； （4）粘膜局部抗感染免疫； （5）聚合IgA激活补体替代途径。 （6）出生后4-6个月合成 (7) 可经初乳传给新生儿,（四）IgE（单体）：（1）血清中含量最低(占Ig的0.002%)；（2）半衰期最短: 2-3天；（3）呼吸道和胃肠道浆细胞产生；（4）两类Fc受体 高亲和力受体与I 型超敏反应有关； 低亲和力受体与ADCC有关。,（五） IgD（单体）： 主要作为成熟B细胞上抗原特异受体，常与IgM在一起存在B细胞表面。存在形式：分泌型 - 血清中，功能不清； 膜结合型 - B细胞表面, （1）是B细胞成熟的重要标志； （2）抗原受体； （3）半衰期: 3天 （4）防止免疫耐受的发生,mIgM,mIgD,未成熟B细胞 仅表达mIgM,成熟B细胞可同时表达mIgM与mIgD,表2-1 人各类Ig的理化和免疫学性质比较,人各类Ig的理化和免疫学性质比较,B细胞识别相应抗原决定基,活化增殖,分化,细胞克隆,产生,相应抗体,多克隆抗体的产生机理,第四节 抗体的制备,一.多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb第一代抗体）：,多克隆抗体（polyclonal antibody）： 指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。,制备,多克隆抗体的应用 免疫学检测 被动免疫治疗和紧急预防优点：作用全面，来源广泛，制备容易存在问题 特异性差, 用于免疫学检测容易出现交叉反应容易出现血清病易传播疾病,二.单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb第二代抗体） 1、单克隆抗体的概念 由一个始祖细胞增殖分化所产生的遗传性状完全相同的细胞群，称为克隆。 由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体称为单克隆抗体，简称单抗 杂交瘤细胞： 骨髓瘤细胞 - 无限增殖； 免疫B细胞 - 合成、分泌特异性抗体。 选择性培养基- HAT培养基：次黄嘌呤(H), 氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。,2、用淋巴细胞杂交瘤技术生产McAb,、动物骨髓瘤细胞，经过长期培养和药物筛选失去了合成次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）能力，本身不合成或不分泌Ig。、将此骨髓瘤细胞与经抗原免疫的淋巴细胞在PEG等融合剂作用下融合后，在含有HAT选择性培养基中培养。,（1）原理,、哺乳类细胞的DNA合成分为从头合成和补救合成两条途径。,磷酸核糖焦磷酸+尿嘧啶,氨基喋呤,核苷酸,DNA,胸腺嘧啶核苷,TK,核苷酸前体,次黄嘌呤,HGPRT,未融合的骨髓瘤细胞在培养基中氨基喋呤的作用下,DNA合成的主要途径（即从头合成）被切断，又由于本身缺乏HGPRT酶或TK酶，不能利用补救合成进行DNA合成，因此死亡。淋巴细胞本身是短寿的，只能存活数天。,、淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合而形成的杂交瘤细胞能够存活下来。因为来自淋巴细胞的染色体弥补了骨髓瘤细胞失去的合成 HGPRT或TK酶的能力，来自骨髓瘤的染色体提供了能在体外长期连续继代的特性。由于每个杂交瘤细胞由一个B细胞融合而成，每个B细胞克隆仅识别一种抗原表位，故经筛选和克隆化的杂交瘤细胞仅合成及分泌一种同源抗体，通过抗体检测可以把它们挑选出来，进行克隆化，即可建立分泌这对特定抗体的单克隆杂交瘤细胞系。、形成的杂交瘤细胞系，既有骨髓瘤细胞大量扩增和永生的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。,（2）过程免疫淋巴细胞制备：用抗原免疫8-12周龄BALB/C小鼠，末次免疫后2-4天取小鼠脾脏制备免疫淋巴细胞。细胞融合：一般选用BALB/C鼠的骨髓瘤细胞系NS1、SP2/O等，以1:2-1:10的比例将骨髓瘤细胞和淋巴细胞混合，以50% PEG作融合剂融合两种细胞，用HAT培养基稀释后分装96孔或24孔细胞培养板，置37温箱培养。筛选：吸取培养10-15天培养细胞的上清，用事前建立的抗体检测方法检测抗体。,克隆化：将抗体检测阳性培养孔的杂交瘤细胞扩大培养，用软琼脂法或有限稀释法进行克隆化。检测单克隆细胞孔上清的抗体，筛选出阳性克隆。杂交瘤的保存和McAB鉴定: 单克隆杂交瘤细胞系用常规的冻存方法在液氮中保存。对McAb进行系统的免疫生物学和理化特性鉴定。McAb的生产：采用杂交瘤细胞体外培养法和体内生长法生产单抗。,单克隆抗体制备过程,人工制备抗体的类型,3、 McAb的优点和缺点： 优点： 结构均一、纯度高、特异性强、血清交叉反应少或无、制备成本低。缺点： 鼠源性对人具有较强的免疫原性，反复使用会诱导产生人抗鼠的免疫应答，削弱了其作用，甚至导致机体组织细胞的免疫病理损伤。,三.基因工程抗体(genetic engineering antibody，第三代抗体） 在DNA水平对Ig基因进行切割、拼接或修饰，导入受体细胞表达的抗体，即由基因重组技术制备的抗体称为基因工程抗体。 如：人-鼠嵌合抗体(chimeric antibody) 改型抗体 (reshaped humanized antibody) 小分子抗体：Fab片段 Fc片段 Fv片段 双特异性抗体(bispecific antibody)： 如：Ig-融合蛋白，抗体导向酶等。,（一） 嵌合抗体(chimeric antibody) 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。,特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,（二）单链抗体(single chain antibody) 用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。,特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。,（三） 人源化抗体(humanized antibody)1、将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。2.将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体,（四）双价抗体与双特异性抗体 (bispecific antibody) 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。 将识别肿瘤抗原的抗体和 识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。,基因工程抗体的优点与缺点,优点：解决了抗体的鼠源化的问题（人源化或完全人源抗体），均一性强，可工业化生产,缺点：亲和力弱，效价不高,知识结构,功能区,免疫球蛋白,结构及酶解片段,基本结构与功能区,四条对称的肽链：两条重链（H）链、二条轻链（L ）链,可变区（VL、VH）-结合特异性抗原,稳定区（CL、CH）-遗传标志、结 合补体、通过胎盘、结合细胞,酶解片段,木瓜蛋白酶： 2个Fab段1个+ Fc片段,胃蛋白酶： 1个 F(ab)2 段+ Fc片段,类型特点功能,IgG：血清含量最高，通过胎盘，再次免疫应答的主 要抗体,IgM：五聚体，分子量最大，最先产生，再次免疫 应答的主要抗体，血型抗体，B细胞抗原受体,IgA ：血清型 分泌型：黏膜局部抗感染，初乳中的抗体,IgD：血清型 含量低 SmIgD： B细胞表面抗原识别受体,IgE：最晚产生，含量极低，介导型超敏 反应和抗寄生虫感染,抗感染中和病毒中和毒素调理促吞噬激活补体,IgG功能,Ab结合Ag后，Fab打开，暴露出补体结合部位,IgG是唯一能经胎盘输给胎儿的抗体,调理作用,参与ADCC,激活补体,通过胎盘,本章提要 免疫球蛋白或抗体的基本结构是由2条相同的重链借链间二硫键连接构成。 每条肽链都具有可变区和恒定区，并且以典型的折