人体寄生虫分子生物学与免疫学研究进展

“动物学研究”系列讲座,程 喆厦 门 大 学 生 命 科 学 学 院,人体寄生虫分子生物学与免疫学研究进展,1 概述：,人体寄生虫学定义 人体寄生虫学（human parasitology）是研究与人体健康有关的寄生虫的形态、生活史、致病、实验诊断方法、流行因素与防治措施的科学，是预防医学和临床医学的一门基础学科。,一、前言,按动物分类系统分类，人体寄生虫隶属于动物界的五个门：原生动物门（Phylum Protozoa)原虫扁形动物门（Phylum Platyhelminthes)吸虫、绦虫线形动物门（Phylum Nemathelminthes)蛔虫棘头动物门（Phylum Acanthocephala)棘头虫节肢动物门 (Phylum Arthropoda)医学昆虫 习惯上分为：原虫、蠕虫(吸虫、绦虫、线虫)、医学昆虫三大类。,2 人体寄生虫分类,现代热带病 （WHO 2000） 疟疾 （malaria） 感染人数4亿4.9亿；每年死亡人数220250万。 血吸虫病 （schistosomiasis） 流行于76个国家，5亿6亿人口受威胁， 2 亿人感染，每年死亡人口50100万。 丝虫病（淋巴和盘尾丝虫病 filariasis) 流行于80多个国家，1.45亿人感染。,3 寄生虫的危害性,晚期丝虫病人（下肢象皮肿）,晚期血吸虫病人,利什曼病（leishmaniasis）现感染人口1200万人锥虫病（非洲和美洲锥虫 trypanosomiasis） 单单美洲锥虫感染者1800万。麻风病 （leprosy）结核病 （tuberculosis）登革热 （date-fever）,媒介昆虫传染的疾病,东方疖,4 背景： 动物寄生虫的分子生物学研究始于20世纪90年代中期，虽然起步较晚，但进展极快。近10年来，研究广度已涉及所有重要的寄生原虫，并已扩展到了具有重要公共卫生意义的部分寄生蠕虫，研究深度已进入寄生虫的基因序列测定分析、分类比对鉴定、诊断方法的建立和免疫学研究领域，建立了近50种寄生虫的cDNA文库。,5 意义： 揭示生命科学的规律。 为动物寄生虫病的研究和防控工作展示了新的前景。,二、寄生虫基因组学研究进展,1. 寄生虫的基因组成和特点 相对于高等脊椎动物,寄生虫基因组除了核(染色体)DNA之外,还有线粒体(mitochondrian)DNA、动基体(kineto-plast)DNA（利什曼原虫，分类和临床诊断）和质体(plastid)DNA （顶复门寄生虫，如：疟原虫、弓形虫、巴贝虫和艾美球虫，分类和临床诊断）等。在一些低等的寄生原虫中,甚至没有成型的线粒体DNA,如某些阿米巴除了染色体DNA外,只有类似细菌质粒的环状DNA和胞质DNA。,基因组大小:寄生虫染色体基因组的大小差别较大,其中,微孢子虫Microsporidia基因组的大小不到10 Mb,在整个真核生物中最小;血吸虫基因组为270 Mb,相当于人类基因组的1/10重复序列：高度、中度和单拷贝重复序列, 不同的寄生虫重复序列所占的比例不同碱基含量:寄生虫基因组碱基G+C含量在30% - 40%之间,AT含量丰富,线粒体DNA： 线粒体DNA具有母系遗传和快速进化的特点,较染色体DNA更易反映种、株乃至型间差异,由于具有较好的稳定性,因此通常被用来评价物种的种系发生。目前已对血吸虫、恶性疟原虫、弓形虫、单殖吸虫(Microcotyle sebastis, G. thymalli, G. salaris, G. derjavin-oides)、血吸虫(S. japonicum, S. mekongi, S. mansoni, S.haematobium, S. spindale)、肝片吸虫Fasciola hepatica、卫氏并殖吸虫Paragonimuswestermani及绦虫(Hymenolepis diminuta,Taenia asiatica, T. solium, T. crassiceps, E. multilocularis, E. granulosus)等多种寄生虫的全线粒体基因组作了测序分析(Littlewoodet al., 2006; Valles Huyseetal., 2007、2008)。,2.寄生虫基因组测序现状,目前寄生虫基因组测出的序列主要分3类:A.完整或接近完整的基因组序列,主要是可读框区的重复序列,通常用重叠群(contigs)表示; B.基因组测序序列标签(GSSs),主要有浏览基因组序列产生或随机克隆、细菌人工载体(BAC)末端序列,用来扩增大片段的DNA（200 kb左右);C.表达序列标签(ESTs),由mRNA转录产生的cDNA,并扩增后进行的测定序列。,已经完成基因组测序的寄生虫包括恶性疟原虫、约氏疟原虫P. yoelii、马来布鲁线虫Brugia malayi、克氏锥虫T. cruzi、小隐孢子虫Cryptosporidium parvum及冈比亚按蚊Anopheles gambiae等的基因组全序列,意义： 基因组分析过程中发现了大约200种蛋白的基因，这些蛋白质参与了免疫逃避。以前的研究显示，在某种复杂的掩护机制之下，寄生虫通过在细胞表面表达不同的蛋白质来逃避宿主的免疫反应。 发现编码参与代谢途径蛋白的基因，虫体存在而人体不存在的特有途径中的基因是潜在的药物靶标。, 比较恶性疟原虫与疟原虫其他种的序列，可以阐明特定株特异性的基因和生理过程。或者比较恶性疟原虫不同株的序列，可以快速地鉴定与免疫、发病机制和人侵有关的变异。 通过功能基因组高通量技术进行大规模的实验。设计DNA微阵列检测基因的表达。例如，分离不同时期的DNA微阵列，确定基因的表达变化，对于特别重要的基因可用敲除或修饰的方法来确定功能。,枯氏锥虫DNA复制和修复机器 ;布氏锥虫代谢的途径和一些细胞生物学 ;硕大利什曼原虫不寻常的基因表达等问题；基因组都是单倍体，长度从25到55Mb大小不等；多数基因都以长且定向的聚集方式组合在一起，暗示主要是以多顺反子地形式进行转录，随后被切割成单独的mRNA分子。,在三个基因组中很少发现表达转录因子的基因存在，但高表达一些含有RNA结合基序的蛋白质。这些观察结果支持了先前的观点，就是锥虫基因表达的调控主要发生在转录后水平。缺乏转录水平的精确调控带来了一个有趣的结果：,只有通过基因的复制或扩增来增加表达水平的提高。,从DNA复制和修复的角度来看，锥虫类和真核生物的其他生物区别很大。基因组不包含牵涉到应对氧胁迫的基因；复制起始装置更像古菌，而非真核生物（生物学和进化学上的兴趣 ）。 锥虫类特异性蛋白激酶，类细菌的线粒体DNA聚合酶，以及特殊的表面蛋白修饰都可以作为潜在的药物靶位点。,编码基因13469个,其中有首次发现的与血吸虫感染宿主密切相关的弹力蛋白酶基因。日本血吸虫一方面丢失了很多与营养代谢相关的基因,如脂肪酸、氨基酸、胆固醇和性激素合成基因等,这些营养物质必须从哺乳动物宿主获得;另一方面,扩充了许多有利于蛋白消化的酶类基因家族的成员。 与宿主相互作用蛋白。,Wellcome Trust Sanger Institute,原虫：疟原虫、利什曼原虫、锥虫、弓形虫、孢子虫蠕虫：包括蛔虫、肝包虫、马来丝虫，捻转血矛线虫，管圆线虫,绦虫丢失了homeobox基因和一些干细胞关键基因如piwi蛋白基因，同时也发现热休克蛋白70和其他一些抗原基因存在种特异性扩增。 比较结果发现，绦虫存在特异的解毒途径，以及依赖宿主营养物质的代谢方式。确定了现有药物可能的作用靶点，为研发高效新疫苗和新药物提供理论支持，给有效预防和控制绦虫病带来新的希望。,第三代测序技术, 它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，是化学法测序的2万倍。 它实现了DNA聚合酶内在自身的延续性，一个反应就可以测非常长的序列。 二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。 精度高，达到99.9999%。,二、微卫星DNA的研究进展及其在寄生虫学的应用,定义：微卫星DNA(microsatellite DNA),又称短小串连重复序列(short tandem repeats,STR)或简单重复序列(simple repeats sequence,SRS或SSR)。相对于卫星序列和小卫星序列,微卫星的重复序列更短,一般只有1 bp6 bp、长度仅为几百个bp的位点。微卫星重复类型有两种,即单核苷酸(A/T、C/G等)和4种二核苷酸(AT/TA、AG/TC、TG/AC、CG/GC)。AC/TG约占50%以上,三、四核苷酸重复类型和其他类型的要少一些。,优点： 微卫星DNA具有RFLP、SSLP、RAPD等遗传标记技术无法比拟的优势 种类分布广泛、高度多态性、杂合性、重组率低, 在群体中变异范围大、长度多态性丰富、高度个体特异性、基因组中且分布比较均匀 基因片段小、容易操作 遵循孟德尔共显性遗传规律、能提供众多有高度遗传信息的新的多态性标记,意义：微卫星DNA多态性标记被应用于动植物遗传育种、遗传图谱的构建、群体遗传学研究、疾病相关基因、免疫和遗传变异机制的研究。,寄生虫微卫星DNA,寄生虫与宿主在进化过程中的相互关系,为阐明寄生虫的进化史提供更有价值的依据;宿主对寄生虫免疫机制;抗药性虫株的变异机制及寄生虫药物的筛选;影响寄生虫流行和传播的因素,这些因素如何导致变异等方面。,三、寄生虫的反式剪接,定义： 反式剪接最早发现于锥虫(Trypanosome)可变表面糖蛋白(VSG)基因中。VSG基因转录后成熟mRNA 5端35 bp是其基因中没有的,这段序列来自另外一基因的小外显子(mini exon)或SL (spliced leader),这段外来的序列与VSG的mRNA 5端接合形成成熟的mRNA。这种由来自不同基因mRNA通过剪接形成成熟mRNA的剪接方式称为反式剪接。SL反式剪接广泛存在于低等真核生物中,虽然各种生物体SL RNA长度,SL DNA长度,SL基因拷贝数不尽相同,但SL RNA及SL反式剪接的现象已被广泛证明,而且越来越多的研究者在关注和应用这一生物现象。,反式剪接与顺式剪接有相似之处也有不同之处。相同的是它们中都存在典型的剪接位点,都需要同样的snRNP来参与。,特点：SL RNA长约100 bp,其中有一Sm样蛋白结合位点, SL RNA的Sm样蛋白结合位点和U6 SnRNA碱基配对可在体外进行,推测这一反应可能吸引SL RNA于剪接体中,从而触发了这一反式剪接的进行。二级结构还有两个茎环结构。SL RNA高度甲基化形成帽子结构。突变SL RNA失去高度甲基化形成帽子结构的能力,会导致不能正常地完成反式剪接。反式剪接中至少两步需要有SR蛋白的参与,在U2 SnRNP加到3端受体之前和之后,SR蛋白发挥重要作用。主要是通过SR蛋白的RS区磷酸化来触发已和U2 SnRNP结合的SL RNA反式剪接。,意义： 应用SL保守序列作为基因标签来获得功能性基因或构建SL cDNA文库。SL cDNA文库的构建和分析可能为寄生虫免疫功能基因的筛选，以及研究寄生虫的阶段特异性表达提供了更加方便、快捷的手段。, SL RNA反式剪接可作为一种重要的修复RNA外显子突变的方法,将正常基因或具有类似功能的基因片段连接到SL序列上,在SL的引导下将正常的RNA序列经反式剪接换下突变的部分,达到修复的目的。, 原核生物不存在的细胞核,没有mRNA的后加工过程;真核生物有细胞核,转录初始mRNA要经过一系列的后加工过程。而在低等真核生物中的初始mRNA经反式剪接在5端加上含有高度甲基化的帽子结构(cap4)的SL RNA,似乎与典型真核生物中5端帽化很相似,从进化角度,这种反式剪接是一种进化过度形式,这种形式是从原始的一共同祖先进化而来,还是不同的群体各自进化而来还有待进一步研究。,四、RNA干扰技术在人体寄生虫研究中的应用进展,RNA干扰技术简介,RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种在真核生物中普遍存在的自身防御反应,是内源或外源性双链RNA (double stranded RNA, dsRNA)引起细胞内有效的特异基因关闭或基因沉默现象。,1. dsRNA被RNA酶家族中的双链RNA特异性核酸内切酶Dicer特异性识别,随后降解为2123个核苷酸长度的3末端突出2个核苷酸的siRNA ( small interfering RNA)。2. siRNA生成后融入一大分子多蛋白复合体RNA诱导沉默复合体(RISC), siRNA随即解链为正义链和反义链。3. 若目的mRNA中有部分序列与siRNA的反义链互补,则siRNA的反义链可与之互补配对并将mRNA在互补区的中间部分降解,从而引起转录后的基因沉默。,dsRNA /siRNA介导途径,RNAi技术的特点高稳定性以3端突出TT碱基的dsRNA尤为稳定,无需象反义核酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期。高度专一性即dsRNA具有高度的特异性,它只能引起与dsRNA同源的基因表达活性大幅度降低,即RNAi有同源基因依赖性。siRNA除正义链3端的3个碱基在序列识别中不起主要作用外,其他单个碱基改变就可能使RNAi失效,而针对同源基因共有序列的RNAi则导致同源基因共同失活。,RNAi技术的特点高效性RNAi机制中存在催化或放大的步骤,少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达,能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下研究目标基因,比基因敲除更简单,更快捷。而且,那些在胚胎中敲除后导致死亡的基因,也可以利用RNAi的方法在培养细胞中进行研究。高穿透性RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持,在线虫中干扰效应甚至可以传到后代去。,RNAi技术鉴定布氏锥虫基因功能,五、寄生虫Micro RNA的研究进展,定义：miRNA是一类内源性非编码的小RNA，在动物中来源于长度约70 bp90 bp的前体。前体经过双链RNA特异性的RNase-Drosha及RNase-Dicer和AGO作用，最终形成18 nt22 nt长度的成熟，然后通过与靶mRNA 3端非翻译区(UTR)结合导致靶基因翻译阻遏或者降解，实现转录后抑制调控。 1993年在秀丽新杆线虫中首次发现MicroRNA(miRNA)lin-4以及let-7，发现为寄生虫的转录后调控研究提供了新的契机。,miRNA和siRNA之间的关系MiRNA：是非编码的单链小分子RNA，在进化上高度保守，通过翻译抑制调控基因表达而不影响转录本的稳定性；miRNAs通常是由较大的（7090 nt）的茎环结构（发夹结构）前体经Dicer酶切割得到的。miRNAs则广泛存在于哺乳动物细胞中，从理论上推测可能参与多种调控作用。 siRNA：针对编码区的双链小分子RNA，每个转录本都可能有很多个siRNAs，是通过降解目标靶，在转录后调控基因表达。也要经Dicer酶切割dsRNA得到。哺乳动物细胞中还没有找到内源siRNA。,血吸虫Micro RNA,Xue等在日本血吸虫中发现了5种新的miRNA，其中4种具有保守性的miRNA(sja-let-7，sja-miR-71，sja-miR-125和sja-bantam)，1种(sja-miR-new1)为血吸虫特有。对这5种新的miRNA在日本血吸虫6个发育期中表达情况的分析表明，这些miRNA表现出高度的期特异性。 let-7：高度的期特异性；毛蚴期非常低，而胞蚴期为毛蚴期的12倍，在尾蚴期达到高峰。因此，推测let-7在中间宿主钉螺中与毛蚴至尾蚴的发育调控相关。 sja-miR-71、sja-bantam：毛蚴期开始表达，尾蚴期达到高峰。而尾蚴是血吸虫的感染期，当尾蚴进入宿主动物细胞后，sja-miR-71的表达立刻降到最低水平然后进入童虫期，并在此后的生命活动过程中始终保持在较低的水平。sja-miR-71在尾蚴期的表达量高于童虫期近1000倍，sja-bantam高达500倍。表达量的变化与生活周期变化相关，与性别无关。,蓝氏贾第鞭毛虫Micro RNA,蓝氏贾第鞭毛虫是miRNA研究中第一个经过克隆和实验验证的原虫。现在已经明确，蓝氏贾第鞭毛虫的至少4种miRNA来源于细胞内的小核仁RNA(Small nucleolar RNA，snoRNA)。,起源于snoRNA的具有miRNA功能的小RNA的发现扩展了寄生原虫的调节性小RNA的来源。该研究首次提出miRNA来源于snoRNA，而不是由miRNA基因本身编码，意味着在miRNA介导的基因沉默过程中很可能有我们尚未发现的新途径。这种现象也意味着在寄生虫和宿主中起源于其它含量丰富的RNA分子(如rRNA，tRNA和snRNA)并且与AGO相关的小RNA很可能也具有调节基因表达的功能。,AGO蛋白在贾第鞭毛虫发育过程中起重要作用，它可以特异性地与m(7)G-帽子结合，从而协助miRNA介导的转录抑制调控。在Dicer的作用下，snoRNA GlsR17被加工为26 nt大小的miRNA(miR2)。荧光素酶(Luciferase)基因在其3端包含6个与miR2作用位点一致的序列，将该酶的mRNA与人工合成的miR2共同温育，则导致荧光素酶的表达量下降40%，而mRNA的稳定性并不受影响。因此，miRNA的转录调控很可能是通过翻译阻遏而不是mRNA降解完成的。另一方面，Dicer基因的沉默则会导致细胞中snoRNA不能被分解，相应miRNA在细胞中的含量急剧降低。同时变异表面糖蛋白(Variant surface glycoprotein，VSG)表达不受限制，由单一表达变成多表达，表明调节蓝氏贾第虫的抗原变异是miRNA的沉默调节功能之一。,六、寄生虫热激蛋白的研究进展,定义：热激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是指所有原核生物和真核生物在生长发育或受到不同理化及病理因素刺激时，机体内新合成或表达量增加的一组蛋白质家族，属非分泌型蛋白质。热激蛋白是物种种系发生中结构和功能最为保守的一类蛋白质，同时也是分子伴侣（Molecular chaperone）中最重要的一类蛋白。热激蛋白的主要生物学功能是帮助相关蛋白质的折叠（Folding）、移位（Translocation）、复性（Renaturation）和降解（Degradation），以保护生物体细胞免受内外不良因素的损害。,作用机理：热激蛋白通常在细胞应激时产生，其表达非常迅速。应激因素包括高温、缺氧、缺血、Ca2+含量增高、癌症和局部损伤感染等多种有害因素，这些因素引发细胞的应激反应，使原本在正常情况下以单体形式与阻遏蛋白结合而不能结合到热激元件（Heat shock element，HSE，即在热激蛋白基因转录中起调控作用的DNA序列）上的热激因子（Heatshock factor，HSF，可识别热激元件）受刺激而与阻遏蛋白分离，与热激元件特异结合，从而启动基因转录。,寄生虫HSP：在寄生虫感染宿主过程中，宿主因寄生虫的入侵而处于应激状态，产生对虫体入侵起保护作用的HSPs。而寄生虫在入侵宿主的过程中，由于环境温度和理化条件的改变，生理和免疫因素的作用，使寄生虫虫体也处于应激状态，产生参与寄生虫分化、增强寄生虫毒力及逃避宿主免疫作用的HSPs。多数寄生虫的HSPs可作为免疫优势抗原，诱导宿主产生抗体。近年来对寄生虫HSPs的研究热点主要集中在原虫、线虫、吸虫等的HSP90、HSP70和HSP60上，也部分涉及sHSP。,应用：HSPs的许多特性显示其具有广阔的应用前景，如HSP70可以作为一个潜在的亚单位疫苗佐剂协同对抗疟原虫的感染。非完整片段的HSP70与完整片段的HSP70比较，两者显示相同的疫苗佐剂特