核酸分子杂交及芯片技术

临床分子诊断学-技术篇7,核酸分子杂交及芯片技术Nucleic Acid Hybridization and DNA Chip Technology,教学内容,核酸分子杂交的基本原理 核酸探针 核酸分子杂交技术方法 DNA芯片技术,1、变性（denaturation） 在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。无共价键断裂。,2、融解温度（Tm值）：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。,影响Tm的因素： （1） DNA碱基的组成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低,（2）溶液的离子强度 低离子强度 Tm值越低 高离子强度 Tm值越高,（3）pH值 pH值5-9 Tm值变化不明显 pH11 不利于氢键形成（4）变性剂 干扰碱基堆积力和氢键的形成,3、复性 变性DNA经过一定处理通过碱基互补重新形成双螺旋的过程。,二级反应动力学,通过随机碰撞配对 缓慢“拉锁链” 快,DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度,影响复性速度的因素:,可逆性(非共价结合)序列特异性(碱基互补配对),紫外吸收黏度沉降系数比旋度生物活性,淬火退火,掌握概念应用：探针单链化,核酸的变性与复性,特点,4、杂交,根据核酸变性和复性的原理，两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交。,分类DNA-DNADNA-RNARNA-RNA,高度特异的允许一定程度的错配严格度,教学内容,核酸分子杂交的基本原理 核酸探针 核酸分子杂交技术方法 DNA芯片技术,一、 概念 探针（probe） 指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。 例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。,核酸探针 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。,靶分子：核酸（DNA or RNA）核酸探针: 1. 与靶核酸分子特异互补的核苷酸链。 2. 被标记，能被特殊方法检测。实质：通过检测探针上的标志物来反应靶分子的 存在与否以及量的多少。,二、分类 根据性质和来源不同：（1）基因组DNA探针 有内含子，杂交效率低 （2）cDNA探针 无内含子，适用于基因表达的检测（3）RNA探针 单链性，特异性高；不稳定，易降解（4）寡核苷酸探针 合成方便，灵敏度受长度限制稍差,二、分类根据标记方法不同：（1）放射性探针 （2）非放射性探针,理想的核酸探针标记物应具备高度的敏感性 标记物与探针结合后，不影响杂交时碱基配对及探针分子的主要理化性质；检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳性率低外，尚需考虑环境污染少，价格低；若用酶标记，应对酶的Km值影响不大，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性。,三、标记,（一）标记物 放射性同位素标记物 非放射同位素标记物,1.放射性 常用的有32P/35S/3H。特点： 检测的灵敏度和特异性高 射线对人体有伤害 放射性物质需特殊的处理 半衰期短不宜存放使用,2. 非放射性标记物 常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素、酶。特点： 敏感性不如同位素标记 稳定性高、检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备 不存在放射性污染,（二）标记法,酶反应法 将标记物（放射或非放射）预先标记在核苷酸分子上，然后通过酶促反应将标记的核苷酸分子渗入探针分子中。,化学反应法 利用标记物(非放射为主)分子上的活性基团与核酸分子上的基团发生化学反应而将标记物结合到探针分子上。,1、随机引物法（random priming） 利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。 将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火，使该片段随机互补结合在单链分子上，在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段作用下，以同位素标记的dNTP为原料，寡核苷酸为引物的3-OH端开始沿5至3方向，合成一条与模板互补的新DNA链。,随机引物（6-8nt）：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096 48=65536,DNA聚合酶Klenow片段： 53DNA聚合酶活性 弱35外切核酸酶活性 无53外切核酸酶活性链替代， 比活高,随机引物法（random priming）,2、切口平移法胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干 切口，切口处形成3-OH末端。大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用，以另一条DNA链为模板。4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5端核苷酸和3端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移。 生成的两条链都被同位素均匀标记。,大肠杆菌DNA聚合酶I的活性种类？,5 3聚合酶活性,3 5外切酶活性,5 3 外切酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶I（1）5 3聚合酶活性,标记,（2）3 5外切酶活性,（3）5 3外切酶活性,切口平移,5-3外切酶活性使缺口平移,5-3聚合酶活性上游链延伸而被标记,3.末端标记法 末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5端或3端的一类标记法。 5端标记法 3端标记法,（1）5端标记法（T4多聚核苷酸激酶） 用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5末端的磷酸基团，使其成为5-OH，然后在（-32P）ATP存在下，经T4多聚核苷酸激酶催化，将位上的32P转移到DNA或RNA分子的5-OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5端均带32P标记。,（2）3端标记法（大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段） 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段有53DNA聚合酶和微弱的35外切酶活性，但无53外切酶活性。对残缺3末端可进行标记。,末端的性质？,教学内容,核酸分子杂交的基本原理 核酸探针 核酸分子杂交技术方法 DNA芯片技术,核酸分子杂交 固相杂交 液相杂交膜上印迹杂交 核酸原位杂交,核酸分子杂交的分类,核酸分子杂交技术是一种信号放大技术。,一、膜上印迹杂交,印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的固相支持物上的方法。,指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。,1固相支持物的选择,常用的固相支持物： 硝酸纤维膜（NC） 尼龙膜 PVDF膜（聚二氟乙烯膜）,2印迹方法 Methods of transfer,虹吸印迹法（Capillary）真空转移法（Vacuum）电转移法（Electrophoretic）,Blot DNA to membrane,Capillary Blotting (upward) no special equipment required!,1975年 E. Southern Southern DNA 印迹转移技术,DNA片段15kb，18小时,Electrophoretic blotting,不宜用硝酸纤维素膜,一般23小时，最多6 8小时,especially good for small fragments resolved by PAGE,Vacuum blotting,3060分钟,more efficient and quantitative than capillarymust apply vacuum evenly and not too strongly,3印迹类型,Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 斑点及狭缝印迹杂交 菌落或噬菌斑杂交 原位杂交,提取DNA,限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳,碱变性,转移到NC膜，高温烘烤,与DNA或RNA探针杂交,放射自显影,Southern blotting hybridization,预杂交,Southern印迹杂交的应用：,检测靶分子为DNA, 检测靶分子是否含有目的基因。 可用于基因组基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析、DNA指纹图谱等。,Northern印迹杂交 应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小，其方法类似于Southern印迹杂交。,RNA极易被RNase 降解RNA酶抑制剂0.1%DEPC处理水(焦碳酸二乙酯),Northern blotting hybridization检测靶分子为RNA，单链，探针制备时需注意是否与靶分子配对。,pancreas kidney skeletal liver lung placenta brain heart,muscle,GEF mRNA,Nouthern blotting hybridization,优点：简单、迅速（直接点样）； 可在同一张膜上进行多个样品的检测；应用：同一种样品经不同倍数的稀释, 可以得到半定量的结果； 核酸粗提样品的检测效果也较好。,Dot and slot blotting hybridization将变性后的DNA或RNA直接点样于膜上,检测的是基因组DNA还是mRNA?,Colony or phage hybridization从重组DNA文库中筛选阳性克隆,核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）,用标记的已知核酸序列为探针，与细胞涂片或组织切片中核酸进行杂交检测的方法。每张标本所用杂交液较少，20100l，为了避免杂交液蒸发后造成杂交液浓缩，需使用密闭的湿盒。在组织或细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量。,核酸原位杂交的基本步骤,1.细胞或组织的固定：载玻片2.组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质3.探针的选择和标记4.杂交5.杂交结果检测,探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究特定核酸序列 在染色体中的精确定位； 探针与细胞内RNA进行杂交，观察该组织细胞中特定 基因的表达水平； 用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进 行杂交，确定有无该病原体的感染。,应用：,FISH(荧光原位杂交)结果地高辛标记的探针用抗地高辛-罗丹明显示(红色)生物素标记的探针，用抗生物素蛋白-FITC显示(绿色),1.荧光染色体原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染色体上的定位。 2.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridization；CGH ),由原位杂交发展起的一些新技术 自学,杂交基本流程,（一）核酸分子与固相介质的结合 1.噬菌体/克隆的转移 2.从凝胶上转移DNA:毛细转移、真空转移、电转移（二）核酸的固定：烘烤（80，2h）、紫外、碱（三）杂交：预杂交、杂交、洗脱（四）杂交信号的检测：放射自显影、非放射性杂 化分子的检测,核酸分子的浓度和长度： 50300 bp, 0.10.5 g,2. 温度: Tm-25,3. 离子强度: Na+浓度约为1 mol/L,4. 杂交液中的甲酰胺: 50%甲酰胺,降低Tm,5. 核酸分子的复杂性,6. 非特异性杂交反应: 封闭,影响杂交的因素,常用封闭物： 变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA， 小牛胸腺DNA 高分子化合物：Denhardt溶液 脱脂奶粉,核 酸 杂 交 分 类 表,斑点及狭缝印迹杂交,教学内容,核酸分子杂交的基本原理 核酸探针 核酸分子杂交技术方法 DNA芯片技术,生物芯片技术采用类似集成电路制作中的微加工技术，将生命科学研究中的若干不连续过程（如样品制备、生化反应、检测和分析步骤）集成到一块几平方厘米的芯片上，使这些分散的过程连续化与微型化，实现对大量生物样品中的各种数据的快速、自动和并行处理和分析。,芯片技术,微阵列芯片 基因芯片 蛋白质芯片 细胞芯片 组织芯片,微流体芯片 毛细管电泳芯片 PCR反应芯片 介电电泳芯片,利用生物分子之间的亲和结合作用。,微缩芯片实验室,生物芯片的种类,