免疫组织化学技术二

,缺点：有些组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺等有内源性生物素活性，需要对组织进行预处理ABC复合物在中性时带正电荷，容易与细胞核等带负电荷结构非特异结合亲合素为糖蛋白，可以与凝集素等碳水化合物结合,优点： 敏感性高 特异性高 一抗和二抗工作浓度低 操作时间缩短 可以多重标记,桥联亲合素-生物素技术Bridged Avidin-Biotin technique， BRAB,原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。,标记生物素-抗生物素技术Labelled Avidin-biotin technique，LAB,原理:以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。特点: 相当高的灵敏度， 省略了加标记生物素步骤，操作较BRAB法简便。 间接LAB法采用生物素化第二抗体，可进一步提高 检测灵敏度,二、葡萄球菌A蛋白法,定义:葡萄球菌蛋白A/SPA是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它能与多种动物IgG的Fc段结合，用SPA标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的各种免疫检测实验,SPA可以和人及多种动物的IgG结合，解决不同动物检测时，需分别标记相应二抗的问题SPA结合部位是Fc段，因此不会影响抗体的活性 SPA具有双价结合力SPA对IgG亚型的结合有选择性，可能出现的假阴性结果,三、凝集素法,凝集素 / lectin 是指一类从植物种子、无脊椎动物和较高等动物组织中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，可使红细胞凝集故称凝集素凝集素具有与特定糖基专一结合的特性，是研究肿瘤细胞膜糖分子变化的一种理想工具凝集素法就是一方面利用凝集素可以与标记物结合，另一方面又可以与细胞膜糖基结合所形成一种亲合反应,直接法是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。间接法是先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体与结合在细胞上的凝集素反应-凝集素-糖法，这种方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与其反应，形成一个“三明治样”的结合物。,四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）,链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲合素。 利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合素-生物素方法,第五节 免疫电镜技术,一、免疫标记电镜技术的原理,免疫电子显微镜（Immunoelectron Microscope， IEM）技术是利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密度产物，在电子显微镜下对高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。特点: 定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器 在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的优点,二、免疫标记电镜技术标本的制备要求,标本制备的要求是保存良好的细胞超微结构，注意保持组织的抗原性，因此在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强。在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。,三、常用的免疫标记电镜技术,免疫胶体金染色法,免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术胶体金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成为特定大小的金颗，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金 。它在弱碱环境下可与蛋白质分子形成牢固的静电结合而不影响蛋白质的生物特性。,分类：按染色步骤 直接法 间接法按标记与包埋的关系 包埋前标记法： 抗原活性保存较好，标记率较高 包埋后标记法： 可对一个材料反复进行标记，试剂用量少,前列腺内分泌-旁分泌细胞免疫胶体金染色显示有降钙素的沉积,应用：细胞表面成份的研究胶体金技术与冷冻蚀刻技术结合-细胞膜蛋白颗粒或其它膜成份进行精细定位电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基因位点,免疫胶体铁细胞化学染色法,胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。,酶免疫电镜技术,酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。,第六节 免疫组化技术的应用,一、免疫组织化学技术的临床应用,荧光免疫组织化学技术的应用,HEP-2细胞抗着丝粒抗体的阳性显色,肾小球抗基底膜抗体的阳性显色,藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌,猴胚肾细胞内弓形虫繁殖 吖啶橙染色绿色-DNA 红色-RNA,恶变组织中肿瘤抗原的检测,人肝癌细胞吖啶橙染色,其他：免疫荧光技术也应用于血液中B细胞和T细胞及其亚群的鉴定、特殊染色体的鉴定、激素和酶的局部组织定位等方面。,酶免疫组织化学技术的应用,提高病理诊断准确性（HE可观察到炎性细胞浸润，ED1染色可观察到巨噬细胞浸润）,Survivin在肝癌细胞核的表达,癌基因蛋白的临床应用,Ki67在小肝癌组织中的表达,辅助诊断免疫性疾病和感染性疾病，观察免疫复合物沉积状况,二、免疫组织化学技术的拓展,荧光激活细胞分类仪（FACS）,FACS是将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、激光和微机信息处理系统等多学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与应用研究的一种先进仪器,共聚焦显微镜技术的应用,激光扫描共聚焦显微镜 (Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM),工 作 原 理,共轭光路使非焦平面的光线被抑制，减少了干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率更高增加了激光扫描部分，可连续、固定范围内小功率扫描，记录动态变化光学结构为共轭聚焦结构，此结构可使样品中间固定层面被激光扫描，通过调节参数可实现样品的多层扫描，俗称“细胞CT”,一般荧光显微镜（左）与激光共聚焦显微镜（右）的区别,LSCM 应用广泛,罗丹明123染细胞线粒体,鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝,检测人类癌细胞表皮生长因子,分层扫描、光学切片,较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测损伤，标记细胞为损伤细胞,较厚层面 (平滑肌损伤可见) 较薄层面 兔动脉血管内皮细胞PI标记观测损伤，标记细胞为损伤细胞,植 物 切 片 三 维 重 建,随机圈取细胞可得到所圈细胞的相对荧光强度值,细胞胞浆胞核同时动态测量Ca离子,其他：随着新软件的不断开发及各个学科的不短发展和相互渗透，LSCM还将会有更广阔的发展前景，并将生命科学的基础研究引向深入。,三、