第17章+流式细胞仪分析技术及应用.ppt

第17章流式细胞术分析技术及其应用，第1节概述1，工作原理2，散射光测量3，荧光测量4，细胞分类原理，第2节数据显示和分析1，参数2，数据显示方法3，门分析技术，第3节流式细胞术免疫分析的技术要求1，免疫检查样品准备2，免疫分析4节流式细胞术在免疫检查中的应用1，淋巴细胞及其子集的分析2，淋巴细胞功能分析3，淋巴造血系统分化抗原和白血病免疫表型4，肿瘤耐药蛋白分析5，艾滋病检查中的6，自身免疫疾病相关HLA抗原分析7，在移植免疫中的应用，测试问题摘要，流式细胞术流式细胞术最大的特点是在不破坏细胞及小器官或粒子的结构和功能的情况下，在荧光探针的帮助下，在分子水平获得多个信号，定量分析或纯化细胞。细胞没有破坏，快速、大量、准确、敏感、量化，流式细胞术测量染色细胞标记的荧光强度的细胞分析器，基于单个细胞分析和分类，测量细胞的物理或化学特性(如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质)，第一节概述，流式细胞术经常检测到的细胞特性，使用激光作为激发光，确保更好的单色性和激发效率；使用荧光染料和单克隆抗体技术相结合的标记技术，确保检测的灵敏度和特异性。利用计算机系统对流动单细胞悬浮液中的单个细胞进行多个参数信号的数据处理分析，保证了检测速度和统计分析的正确性。一、工作原理、(1)流动系统(2)光学系统(3)数据处理系统、1。流式细胞仪的基本结构：由样品和鞘液体组成的被测试细胞的单细胞悬浮荧光染料标记的单电阻染色干净气体压力样品管到流动室的样品流鞘形成：正常检测辅助样品流的基质液体。主要作用是包裹样本流的周围，使样本流中的细胞位于喷嘴中心，从而接近孔壁，堵住喷射孔。(1)流式系统、流式系统图、FCM的流式系统(形成单个单元流的方法)、采样管、鞘管、激光光：空冷氩离子激光分色反射镜：反射长/短波长、短/长波长光束基本工作原理、基本过程、流式细胞仪和显微镜的差异、细胞在液体柱上与激光束相交时向周围360立体角方向散射的光信号、其强弱与细胞的大小、形状、细胞内粒子折射等有关，主要分为前向散射和横向散射光。 第二，散射光测量，第二，前散射光(forwardscatter，FS):激光束照射细胞时，光以相对轴的小角度(0.5 10)正向散射的信号用于检测细胞等粒子的表面特性，信号强弱与细胞体积大小成正比。前光散射图，侧光散射(sidescatter，SS):激光束照射细胞时光以90度散射的信号，用于检测细胞的内部结构特性。侧散射光图、测量的FS和SS信号可以通过计算机处理，得到只能将未染色的活细胞分析或分类为散射光信号的FS-SS图。这是血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。，淋巴细胞、单核、中性粒细胞、光散射测量的最有效用途：特定子集在异种群体中确认，荧光信号在被检查细胞中显示的特定荧光染料激发后发生，释放的荧光波长与这里的光波不同。每种荧光染料可以产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性过滤器，将不同波长的散射光和荧光信号分离，发送到不同的光电子管道。通过选择不同的单个电阻和染料，可以在一个细胞内同时测定多种不同的特征。线性放大器和对数放大器，3，荧光测量，荧光染料的特性，这里的波长发射波长，荧光校正，通过流式细胞仪的细胞分类主要是在需要进一步培养和研究哪些特性的细胞时完成的。四、细胞分类原理、压电晶体、机械振动生成、充电、充电、(a)分类基本原理、(a)分类速度：单位时间内分类的细胞数。与悬浮液中的细胞含量成正比。分类纯度：除以所有收获的细胞的比例，选择的目的细胞。排序收获量：设置实际收获的分离细胞和通过测量点的分离细胞的比例。纯度成反比。分类产量：您可以在细胞悬浮组中确认目标细胞的总量，然后获得分类后目标细胞的实际产量。与分类速度成反比。(b)分类的技术要求，参数：FS、SS、FL数据显示方法(单参数直方图、双参数分布、二维轮廓、假三维轮廓、三参数分布)语句分析技术设置，第二部分数据显示和分析，FS: 单参数直方图2参数直方图3360点图2维轮廓3参数直方图多参数分析、直接分析矩形图、门分析3360REGION和GATE设置、2、数据显示方法、一维参数(散射光或荧光)和粒子数(计数)，由相同散射或荧光强度的粒子组成，(a)单参数直方图、单参数直方图、双参数直方图：纵轴和横轴分别表示被测量细胞的两个测量参数，可以根据这两个参数确定细胞在图表中的表示位置。双参数信号通常使用对数信号，最常用的点是点密度图。其中，每个点代表一个细胞，点图表示使用粒子密度反映相同散射或荧光强度的粒子数。(b) 2参数直方图，1 .双参数直方图，双参数直方图，2 .二维轮廓图由相似地图的等高线组成，其本质也是双参数直方图。在轮廓图中，每个连续曲线都有相同的细胞相对或绝对代数，即“轮廓”。曲线的水平越高(越是内线)，代表的细胞就越多。等高线越密，细胞数量的变化率就越高。二维轮廓，3 .假三维轮廓，(3)三参数直方图，多参数分析：细胞显示多色荧光，被激发后，结果荧光信号和散射光信号可以根据需要结合分析。(4)在流式细胞仪的多参数分析、闸门设置：所选参数之一的直方图中，根据该图的单元分布选择要分析的特定单元组，并要求该样本的所有其他参数组合的直方图仅反映该细胞的分布。根据门的形状，它将再次分为线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字形门。第三，门分析技术，a淋巴细胞b单核细胞c中性粒细胞，a，b，c都是弗里门，线性门，region设置3360区域阈值(Region，R)和门(gate，G)，d1cd 4/cd3-d2cd 4/cd3 d3cd 4-/cd3-d4d4d 4-/cd3(交叉语句分析中G=D1 D2 D3 D4)。，样品制备标记染色液相芯片技术质量控制，4节流式细胞术免疫分析技术要求，外周血淋巴细胞样品制备分离单个核细胞培养细胞的样品制备蛋白酶消化系统吹制，附着细胞剥离洗涤尼龙网络过滤，第一，免疫检测样品制备， 新鲜物理组织单细胞悬浮液的制备机械酶处理化学试剂处理表面活性剂处理单细胞悬浮液保存低温(1年)乙醇或甲醇保存(2周)甲醛或聚甲醛保存(2月)，应用条件：为高量子产率和消失系数为488nm的激发光波长，强吸收发射光波长和激发光波长之间的大波长差异不影响抗体特异性，标记单抗和激发光波长二、常用荧光染料和标记染色、激光、细胞悬浮、异硫氰酸盐氟化、状态红、能量转移复合染料、藻胆蛋白、(a)几种常用荧光染料，几种常用荧光染料用化学方法结合了两种不同激发波长的染料，共488nm，能量转移复合染料，488nm，575nm，670nm红色荧光，花色素5，藻红蛋白，能量转移复合染料机制，荧光染料和细胞成分的四种结合结构亲和嵌入联合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记法直接标记33366 无需标记多个抗体组合标记，(2)使用免疫荧光标记的免疫乳胶粒子的应用-液体芯片技术可以将小乳胶微球分别染成数百种不同的荧光颜色，混合不同检测物的乳胶微球，然后添加标本，在悬浮液中特定地结合粒子，激光照射后，对不同测量对象产生不同的颜色，进行定量分析。 检测速度很快，又被称为“液体芯片”。第三，免疫乳胶粒子技术的应用，小乳胶微球数百种不同的荧光颜色染色(固相芯片在芯片的坐标位置使用探针对基因进行特定编码；液相芯片用颜色编码，检测不同的发光素分子，定量分析FCM的可溶性物质，以适当的准备方式处理红细胞物理组织标本的机械温度2537，pH7.07.2，4，流式细胞免疫学的质量控制，(a)单细胞悬浮液制造的质量控制，温度pH染料光电倍增管(PMT)校准：可确保检测样本时仪器处于最佳灵敏度操作状态。绝对系数校正：可确保计数精度。Flow-check，Flow-set，Flow-count，(3)设备运行质量控制，相同标准：免疫荧光中的语音对照组，同源未标记单电阻作为对照，选择电压，以确保特异性。全面质量管理：与试验对象标本一起进行标记和测试，结果达到目标值，表明这次实验结果是可靠的。(4)免疫检查的质量控制，流式细胞术目前广泛应用于免疫学基础研究和临床应用的各个方面，流式细胞术将细胞表面的抗原成分进行标记分析，区分各种细胞的特性，为细胞免疫研究增加了有效的手段和帮助。第四节免疫检查、T淋巴细胞和子集分析Th(CD3 CD4 CD8-T)；CD3 CD4-CD8 T(TC)B淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19 CD5 ):产生IgM型自身抗体，参与免疫调节，与自身免疫疾病相关的B2(CD19 CD5-):受外抗原刺激，进行高亲和性特异性抗体NK细胞分析NK(CCD 19 CD5-): 用于预后判断和小残留病变的检测等，CD4 Th细胞，CD4 /CD8比例，MDR()表示对化疗药物的耐药性。 4、肿瘤耐药基因分析、5、艾滋病检查中，HLA-B27是58% 97%的强直性脊柱炎(AIDS)患者，6、自身免疫疾病相关HLA抗原分析、FCM是一个强大的技术平台，在移植免疫分析中应用越来越广泛。目前，FCM在移植免疫中的应用主要包括流式细胞术交叉排列(flowcytometriycross-matching，fcxm)和群体反应抗体(Panelreactiveantibody，PRA)检测。7、移植免疫的应用、测试问题、流式细胞术的分析和检测原理是什么？流式细胞术分析中前向散射、横向散射和荧光的检测意义。什么是荧光校正？什么是液体芯片技术？细胞分类的基本原理。如何解释FCM分析中数据的显示方式、结果和集语句分析的含义？FCM分析和样品准备方法是什么？在流式细胞分析之前，如何确认仪器的工作状态？使用什么样的校准物？流式细胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？流式细胞术的临床价值是什么？流式细胞术分析中常见的荧光素是什么？他们的特点怎么样？摘要，流式细胞术(FCM)在分子级别获取多