基因研究技术

6 分子生物学研究方法(下),基因功能研究技术,6.1 基因表达研究技术,6.1.1 基因表达系列分析技术6.1.2 RNA的选择性剪接技术6.1.3 原位杂交技术 6.1.4 基因定点突变技术,6.1.1 基因表达系列分析技术,概念：以DNA测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术原理：用锚定酶和标签酶两种限制性内切酶切割DNA分子的特定位置(靠近3端)，分离出短核苷酸序列(9lObp)。它包含了该转录本的足够信息。将一个体系的所有转录本中这一短序列分离并连接到一个克隆载体中进行测序便可以得到该体系的所有转录本的表达情况。,操作步骤,以biotin-oligo dT为引物将mRNA反转录合成双链cDNA，以一种锚定酶（Anchoring Enzyme, AE）进行酶切后，收集其cDNA的3端部分。将收集的3端cDNA等分为两部分，分别同接头A、B相连接。每一种接头的结构都由PCR扩增引物A或B的序列、标签酶识别位点和锚定酶识别位点三部分组成。,连接产物以标签酶酶切后用Klenow酶补平5突出端，得到两组分别带有接头A、B的短cDNA片段（约50个碱基）。混合并连接两组短cDNA片段，形成一个约100个碱基的双标签体（ditag）群，并以引物A和B对其进PCR扩增。 用锚定酶切割扩增产物，分离纯化去除接头后的双标签体（约26个碱基），并使之相互连接成为大片段的连接体，克隆至质粒载体内形成一个SAGE文库以备集中测序。对测序得到的标签数据进行分析处理。,6.1.2 RNA的选择性剪接技术,概念是指用不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。,分类,选择性剪接的研究方法（RT-PCR）,6.1.3 原位杂交技术,概念用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段分类RNA原位杂交技术染色体原位杂交技术,RNA原位杂交技术,原理：是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度和离子强度等）可按碱基互补原则退火（annealling）形成双链的过程。这一杂交过程具有高度的特异性。待测的核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA核细胞mRNA。用于检测的已知核酸片段称之为探针（probe）。常用的标记物包括放射性标记和非放射性标记物两大类。,组织细胞的固定预杂交杂交冲洗显示,RNA原位杂交技术的操作过程,荧光原位杂交,FISH技术操作步骤,探针的准备和标记；探针和染色体的杂交；信号检测；杂交信号与分带染色体的比较,6.1.4 基因定点突变技术,通过改变基因特定位点的核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用来研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位点等。,体外寡核苷酸介导的DNA突变技术,重叠延伸介导的定点诱变,6.2 基因敲除技术,6.2.1 基本原理6.2.2 高等动物基因敲除技术,6.2.1 基本原理,基因敲除(gene knock-out)又称基因打靶,通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基因改造,具有专一性强,染色体DNA可与目的片段共同稳 定遗传等特点.,完全基因敲除,打靶载体：新霉素（neomycin, Neo）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase),条件型基因敲除,条件性基因剔除：对于重要功能基因进行完全基因敲除会导致胚胎死亡，影响基因功能研究。因此常用Cre/LoxP和FLP/FRT系统进行组织特异性敲除。通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除,6.2.2 高等动物基因敲除技术,6.3 蛋白质及RNA相互作用技术,6.3.1 酵母单杂交技术6.3.2 酵母双杂交技术 6.3.3 RNAi技术及其应用,6.3.2 酵母双杂交技术,用于分离与已知靶蛋白质相互作用基因的方法 原理许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。酵母的转录激活因子GAL4BD (binding domain)AD (activating domain),试验流程,酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。将这两个质粒共转化于酵母细胞中。,特点,优点蛋白-蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。缺点它并非对所有蛋白质都适用假阳性的发生较为频繁。在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。,6.3.1 酵母单杂交技术,概述顺式作用元件存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。 反式作用因子是指能直接或间接地识别或结合在顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。,原理,应用,6.3.3 RNAi技术及其应用,概述RNA干涉(RNA interference，RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(PTGS)。,您现在的位置：生命经纬生物频道实验技术生化与分子生物学实验文章正文,RNA干扰技术的原理和应用,BIOX.CN,时间：2007-6-26,来源：生命经纬,1. 凝胶阻滞试验（gel retardation assay） 又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），用于体外研究DNA与蛋白质相互作用。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。,6.4 DNA与蛋白质相互作用研究,凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带,蛋白质与DNA结合,（a）没有加入竞争DNA的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（b）加入超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（c）竞争DNA与探针DNA分别结合不同的蛋白质，仍然出现阻滞条带。,图 在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用,2. DNaseI足迹试验 在DNaseI足迹试验（DNA foot-printing assay）过程中，首先将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链的单个末端标记的双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA链只发生一次磷酸二酯键断裂。如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端1个、2个、3个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的连续的DNA片段梯度群体。,如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么，它就将保护这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹”,（b） 位点5、6、7因受特异结合蛋白质X的保护而