遗传病基因诊断学

基因诊断,主 要 内 容,一、基因诊断概念二、基因诊断基本原理及常用技术 1、核酸分子杂交 2、探针标记 3、PCR技术 4、DNA测序 5、DNA微阵列（DNA芯片）三、基因诊断方法四、基因诊断-遗传病产前诊断,一、基因诊断概念,传统诊断法: 表现型 推测 基因型。基因诊断法: 基因型 推知 表现型。 检测核酸 分析 特定基因 判断 基因型。 基因诊断特征:1. 检测DNA不受被检测来源的限制。 2. 症状前诊断成为可能。3. 对遗传病可进行分子水平再分类-遗传异质性的分子水平阐明。,二、基因诊断基本原理及常用技术,1、核酸分子杂交 双链DNA 变性 单链 复性 杂种DNA 加热,强酸, 探针 强碱,变性剂探针: 一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列,作为工作状态的探针必须是单链。常用探针种类: 基因组DNA, cDNA,人工合成的寡核苷酸。,制备待测核酸样品,分离、变性、转移、固化DNA片段,杂交,加入标记核酸探针,检测杂交信号,标记核酸探针,预杂交,制备核酸探针,漂洗去除未参与杂交的标记探针,核酸分子杂交操作程序,（1）斑点杂交（Dot blotting hybridization）,主要用于基因缺失和拷贝数改变。应用：1）混合样品DNA鉴定2）基因缺失检测3）基因表达分析ASO探针（等位基因特异性寡核苷酸）-检测已知点突变。,1975年Southern建立的检测DNA技术。基因组DNA 限制酶消化 凝胶电泳分离 变性 转移到 硝酸纤维素膜(尼龙膜) 固定 预杂交 探针 杂交 洗膜 放射自显影 分析杂交片段的大小及密度。可检测: DNA片段的缺失,插入,重排等。 改变限制酶酶切位点的点突变。 DNA扩增等拷贝数改变。 RFLP等多态性。,（2）Southern印迹杂交,检测RNA的分子杂交技术提取组织总RNA oligodT mRNA 含甲醛的 琼脂糖凝胶电泳分离 转移 预杂交 探针 杂交 洗膜 放射自显影。 检测特异mRNA大小和表达量。,（3）Northern 印迹杂交,染色体标本上，组织切片上分子杂交原位杂交-3H标记探针FISH-荧光素或生物素标记应用于基因定位，染色体数目及结构异常诊断。组织切片上的FISH-mRNA水平表达及一些病原体感染诊断。,（4）原位杂交及荧光原位杂交（Flurescence in situ hybridization，FISH）,肌球蛋白mRNA在胚胎小鼠心脏原位表达,荧光原位杂交（FISH）与染色体涂染,1985年美国cetus公司的Kary Mullis创建，80年代一向革命性技术，1993年获诺贝尔化学奖。模拟生物体内的DNA复制，在体外DNA聚合酶酶促合成某一特异DNA片断的技术。,3、PCR技术（Polymerase chain reaction),步骤：,变性 20-30周期 复性 延伸引物的核苷酸顺序将决定扩增片段特异性及其长度。该技术灵敏度高，特异性强，操作简便，快捷，目前自动化操作。,PCR扩增,（1）PCR-RFLP,PCR扩增后酶切，检测点突变或多态。,（2）PCR-SSCP,单链构象多态（single strand conformation polymorphism, SSCP）：DNA单链在非变性胶中电泳时形成立体构象，其构象与碱基顺序相关。长度相同，但只要一个碱基的差别 形成不同构象 泳动速率不同 形成不同泳动带。能检测已知和未知点突变。,- primer - 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 变性 单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影 1.为正常 结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子,PCR-SSCP过程,(3) PCR-DGGE,变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）Tm值-DNA双链50%解链温度。Tm值主要与碱基组成相关。PCR扩增后的DNA，在变性梯度由低到高的聚丙烯酰氨凝胶电泳过程中，Tm值低的DNA片段先解链，电泳速度变慢 一个碱基差异也能改变Tm值导致泳动速率改变 产生泳动变位，能检测已知，未知点突变。检测突变率比PCR-SSCP高。,4、DNA测序,Sanger法-双脱氧核苷酸末端终止法。双脱氧核苷酸不能形成5磷酸和3OH之间的磷酸二脂键（因3也脱氧）而终止反应。4个反应体系分别加入ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP，将产生不同长度（在A，G，C，T处随机终止）的DNA片段，分别在变性凝胶电泳分离呈梯状带型，自下而上是5 3被合成的DNA链顺序。,DNA自动测序,应用如上原理，不同的是： 4种不同荧光染料标记的dNTP掺入酶促反应(不用分4个反应体系)。 经过毛细管凝胶电泳分离(不用分4个泳道)。 激光分析和计算机处理，直接标出碱基序列。,焦磷酸测序,焦磷酸测序检测结肠癌KRAS基因突变,下一代“克隆”测序,5、DNA微阵列（DNA芯片）,在杂交测序基础上发展起来的： 大规模集成电路手段把成千上万个寡核苷酸探针有规律地排列在指甲大小的芯片上-制作寡核苷酸阵列。 将待测的DNA，RNA或cDNA用荧光标记后在DNA芯片上与探针杂交。 用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，配合计算机处理荧光信号，得出所需信息。,High-resolution melt curve analysis (HRM),Identification of copy number changes by array comparative genomic hybridization (CGH),三、基因诊断方法,1、直接诊断：直接检测致病基因缺陷性质。 能作直接诊断的条件： 遗传方式已知 病因基因或cDNA已克隆分离 突变性质与疾病关系已阐明 基因突变类型： 1、DNA碱基置换(点突变) 2、DNA片段的缺失、插入、重复等 3、动态突变,检测点突变,已知点突变检测：1、RFLP 2、ASO探针杂交法 3、等位特异性PCR 4、PCR-SSCP5、PCR-DGGE,未知点突变检测：1、PCR-SSCP2、PCR-DGGE3、DNA测序4、DHPLC,（1）RFLP方法-检测已知突变,基因较大片段缺失或插入 酶切片段长度改变。基因点突变正好发生在某限制酶识别位点 酶切点消失或增加 酶切片段长度改变。酶切图谱法检测的缺点: 不直接影响酶切点的突变不能检测到。 产生的片段大小太相似也不易被检测到。特异性扩增含酶切位点的PCR扩增片段，再经酶切后电泳检测-更简便,快速,也能弥补缺点。,镰状细胞血红蛋白（HbS）,Mst II,PCR,（2）ASO探针杂交法-检测已知点突变,等位特异性寡核苷酸探针（allele specific oligonucleotide probe，ASO）以点突变为中心合成20bp左右的一对探针： 与正常序列杂交的探针与异常序列杂交的探针优点：探针可准确合成；不改变酶切位点的突变也能检测。缺点: 突变位点及性质清楚的前提下才能合成ASO探针，只能检测已知点突变。,2、间接方法-连锁分析法,基因内或基因近旁DNA多态为遗传标记进行连锁分析，判断被检者是否得到带有致病基因的染色体而作出诊断。DNA多态性（DNA polymorphism）：群体当中不同染色体上的基因每几百个bp中大约有1个的比例存在碱基取代，但对表现型无改变，这种变异的频率在群体中占1%以上，这种现象叫DNA多态性。这种变异以孟德尔共显性遗传方式传递。,第一代遗传标记：限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）,第二代遗传标记：数目可变的串联重复（Variable number tandem repeat，VNTR）,大约几十bp长的碱基序列在人群中其重复的拷贝数不同所产生的多态，一般在非编码区中。 小卫星DNA(628bp)n 微卫星DNA(26bp)n ，也称STRP（small tandem repeat polymorphism）例如:FVIII基因 ST14(DXS52)位点 (60bp)nDMD基因intron 44、45、49、50中 (CA)nPAH基因 intron3中STR(4bp)n优点: 群体中等位基因数目多，杂合子频率高。,第三代遗传标记：单核苷酸多态（Single nucleotide polymorphism，SNP）,基因组中广泛存在的碱基置换，大约几百1kb之中有一个。应用于：疾病的关联分析基因功能鉴定基因发现和制图候选基因发现,连锁分析举例,连锁分析举例,连锁分析举例,连锁分析举例,连锁分析的优点,不一定清楚病因基因的分子基础，只要有基因内或近旁DNA多态标记就可以分析。缺点:1、必须要有先证者以及家系中相关各成员的DNA才能分析。2、携带者是杂合子时才能分析。3、连锁分析要充分认识到由于减数分裂时同源染色体交叉互换导致误诊的可能性。,四、基因诊断-遗传病产前诊断,1、甲型血友病（Hemophilia A）：FVIII因子遗传性缺陷所致的凝血障碍性出血性疾病.发病率：男性的1/50001/10000，XR。症状:自然或轻微外伤后出血不止。皮下、关节、肌肉出血-关节强直、劳动力丧失。颅内出血可危及生命。根据血浆中F浓度可分为轻、中、重度。,诊断、治疗,血浆代用品 分离的F因子 基因工程产品FVIII因子 基因治疗FVIII基因于1984年克隆并定位于Xq28，全长186kb，含26个外显子，25个内含子，mRNA全长为9kb，编码2351个氨基酸。由于致病基因突变类型复杂多样，且突变位点不集中-直接诊断受限制。,间接基因诊断,方案：先检测SRY，ZFY/ZFX基因，诊断性别后间接诊断连锁分析1、首先ST14（DXS52）位点的VNTR多态；2、FVIII基因intron 18中的Bcl I/RFLP；3、FVIII基因intron 22中的Xba I/RFLP；4、FVIII基因intron 13中的（CA）n多态。直接诊断：检测i22的倒位。,2、假肥大型肌营养不良症(DMD/BMD),肌萎缩中占60%。由于抗肌萎缩蛋白（dystrophin）遗传性缺陷所致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病。发病率为1/3500，XR遗传。BMD比DMD发病晚，病情轻。主要症状：通常3-5岁发病，开始走路不稳，鸭型步态，上楼梯困难，Gower征阳性，进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大，10多岁下肢瘫，一般在20多岁之前死于心衰或呼吸衰竭。,生化检测：血清中磷酸肌酸激酶（CPK）升高。肌电图：肌源性改变等。1987年Kunkel等克隆DMD基因，定位于Xp21，全长2400kb，含79个外显子，cDNA长度为14kb。目前已知DMD的50%80%是由于DMD基因不同区段的缺失，缺失发生热点区位于DMD基因5端（219）以及外显子4452。,直接基因诊断：应用多重PCR（multiplex PCR）检测缺失，12对引物（43），能检测98%缺失。多重链接依赖探针扩增（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA ）间接诊断: RFLP连锁分析（CA）n连锁分析：DMD基因5 端和3 端，内含44、45、49、50中的（CA）n多态，进行单体型连锁分析。,多重PCR检测缺失,Duchenne/Becker型肌营养不良(DMD/BMD)方法：根据DMD基因缺失的分布设计12对引物，分成3组： 第1组为外显子19、43、45、34 引物 第2组为外显子51、12、50、53 引物 第3组为外显子48、17、 8、52 引物分别对患者基因组DNA进行扩增，每次扩增均同时设空白和正常对照。,1:DL2000marker；2:正常对照(第1组引物)；3.4:检出 外显子19的先证者和胎儿；5:正常对照(第2组引物)；6.7:检出 外显子51的先证者和胎儿；8:正常对照(第3组引物)；9.10:检出 外显子48的先证者和胎儿。,3、苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）,由于苯丙氨酸羟化酶（phenylalanin hydroxyrase，PAH）遗传性缺陷所致的遗传性氨基酸代谢病发病率为1/16500，AR遗传。临床表现：智力低下黑色素形成障碍尿有特殊氨味,诊断、治疗,PAH基因于1983年定位于12q24，全长85kb，含13个外显子，mRNA全长2.4kb，编码451个氨基酸。PAH基因缺陷-以点突变为主，且1/3点突变集中于外显子7，另外外显子6，11，12也较集中。PKU基因诊断策略:1、应用内含子3的STR多态进行连锁分析。2、应用PCRSSCP，PCRDGGE技术检测外显子第7、6、11、12的点突变。,6%DGGE检测家系成员PAH基因外显子6的电泳图,：,1 1 2 2,1,2,1,N,？,4、先天愚型（Down综合征）,最常见的常染色体病，发病率为1/7001/800，主要是21三体所致（约5%是易位型和嵌合型）。临床特征：先天性智力低下、特殊面容、体格发育迟缓、伴先天畸型，特征性皮肤纹理等。基因诊断：1、应用D21S11为遗传标记的定量PCR；2、荧光原位杂交（FISH）方法；3、荧光定量PCR（QF-PCR）。,荧光定量PCR方法检测21-三体,五、产前基因诊断进展,遗传病基因诊断主要应用:1、产前基因诊断-终止妊娠；2、携带者基因诊断-指导婚姻、生育；3、症状前诊断-如HD，SCA等。其中最主要的是产前基因诊断：孕7-8周绒毛孕16-2