植物生理指标测定

实验22过氧化物酶活性的测定过氧化物牌是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握常用的测定过氧化物酶的方法一愈创木酚法。一、原理在过氧化物酶(peroxidase)催化下,H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470m处有最大光吸收，故可通过测470 nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。二、材料、仪器设备及试剂(一)材料马铃薯块茎。(二)仪器设备722型分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。(三)试剂(1)0.05 mol/L.pH5.的磷酸缓冲液。 (2)0.05 mo/L愈创木份溶液。(3) 2%H202。 (4)20%三氯乙酸。三、实验步骤(一)酶液的制备取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转人离心管中,于3000g离心10 min,上清被转人25 mL,容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并人容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。(二)过氧化物酶活性测定酶活性测定的反应体系包括:2.9 mL.0.05 mol/L磷酸缓冲液; 1.0ml.2%H2O2 ； 1.0mL.0.05mol/L愈创木面和0.1mL酶液。用加热煮沸5min的酶成为对照，反应体系加人酶液后，立即于37C水浴中保温15min.然后迅速转人冰浴中，并加人2.0ml.20%三氯乙酸终止反应，然后，过虑(或5000xg离心10min),适当稀释.470mm波长下测定吸光度。四、结果计算以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)。过氧化物酶活性=A470VTWVs0.01tu/（g.min）式中:A470为反应时间内吸光度的变化 :W为马铃薯鲜重.g；t为反应时间，mins；VT为提取酶液总体积，ml；Vs为测定时取用酶液体积，mL。实验24超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）一、原理超氧物歧化酶(Superxide dismtae, SOD)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基(O2-的酶,它催化下列反应:2O2-+2H+ H2O2+02反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-, O2-可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560m处有最大吸收。而SOD可清除O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂(一)材料水稻或小麦叶片。(二)仪器设备分光光度计，高速台式离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管，荧光灯。(三)试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。（3）100mol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。（4）20M核黄素溶液：取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。（5）750mol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存。三、实验步骤酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5-2ml于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4的冰箱里。显色反应 取试管（要求透明度好）4，2为样品测定管，2为对照管，按表39-1加入各溶液。混匀后将1支对照管置于暗处其他管于4000lx日光反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。表39-1 各溶液加入量试 剂（酶）用量(ml)终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液130mmol/L Met溶液750mol/L NBT溶液100mol/L EDTA-Na2液20mol/L核黄素酶 液蒸馏水总体积1.50.30.30.30.3 0.05 0.253.013mmol75mol10mol2.0mol2支对照以缓冲液代替酶液SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性： SOD总活性=Ack-AEV0.5WVtAck式中 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示；Ack为照光管的消光度值；AE为样品管的消光度值；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样鲜重，g。苯酚法测定可溶性糖一、原理植物体内的可溶性糖是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是:糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛(分子式见蒽酮法)能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10- 100 mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485m波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定吸光度。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定160 min以上。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料新鲜的植物叶片。(二)仪器设备分光光度计，水浴锅，刻度试管，刻度吸管。(三)试剂(1) 90%苯酚溶液：取90g苯酚(AR),加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。(2) 9%苯酚溶液。取3 ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水至30 ml,现配现用。(3)浓硫酸(比重1.84)。 (4) 1%蔗糖标准液。将分析纯蔗糖在80 C下烘至恒重，精确称取1.000g加少量水溶解,转人100 mL容量瓶中，加人0.5 m浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度线。(5) 100 ug/蔗糖标准液。精确吸取1%蔗糖标准液1mL，加入100mL容量瓶中，加水至刻度。三、实验步骤1.标准曲线的制作取20mL刻度试管11支，从010分别编号，按表2-32-3加人溶液和水。表2-32-3 苯酚法测可溶性糖绘制标准曲线的试剂量试剂管号01、23、45、67、89、10100ug.L-1蔗糖液/mL00.20.40.60.81.0水/mL2.01.81.61.41.21.0蔗糖量/ug020406080100然后按顺序向试管内加人1mL9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以520s加人5 mL浓硫酸,摇匀。比色液总体积为8mL,在室温下放置30min,比色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定吸光度，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线,求出标准曲线方程。2.可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10-0.30g,共3份(或干材料)，分别放人3支刻度试管中，加入5-10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min(提取2次)，提取液过滤入25mL容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。3.测定 吸0.5ml 样品液于试管中(重复2次)，加蒸馏水1.5mL，步聚与制作标准曲线相同，按顺序分别加人苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定吸光度。由标准曲线查出糖的含量。四、结果计算按下式计算测试样品的糖含量可溶性糖含量=从标准曲线查的糖的含量测定用样品液的体积提取液体积稀释倍数106样品重量100%实验53脯氨酸含量的测定 在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻)，植物体内脯氨酸(proline,Pro)的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸,因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此,亦可作为抗寒育种的生理指标。一、原理当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出(或用同归方程计算）脯氨酸的含量。二、材料、仪器设备及试剂(-)材料待测植物(水稻、小麦、玉米、高梁、大豆等)叶片。(二)仪器设备分光光度计，研体，小烧杯，容量瓶，大试管，普通试管，移液管，注射器，水浴锅，漏斗，漏斗架,滤纸，剪刀。(三)试剂(1)酸性茚三酮溶液:将1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸和20ml 6mol/L磷酸中.搅拌加热(70)溶解，贮于冰箱中。(2)3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸加蒸馏水溶剂解后定容至100mL(3)冰醋酸。(4)甲苯。三、实验步骤1.标准曲线的绘制(1)在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒人小烧杯内,用少量蒸馏水溶解，然后倒人250 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。(2)系列脯氨酸浓度的配制。取6个50mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5 mL、1.0mL、1.5 mL、2.0mL、2.5mL及3.0mL用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1 ug/mL、2 ug/mL、3 ug/mL、4 ug/mL、5 ug/mL及6ug/mL。(3)取6支试管，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30 min。(4)冷却后各试管准确加人4mL甲苯，探荡30s,前置片刻，使包素全部转至甲苯溶液。(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm波长处进行比色。(6)标准曲线的绘制:先求出吸光度值(y)依脯氨酸浓度(x)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 mL测定液中脯氨酸的含量(ug/mL)。 2.样品的测定 (1)脯氨酸的提取:准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g,分别置大管中，然后向各管分别加人5mL3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10 min(提取过程中要经常播动),冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。 (2)吸取2mL提取液于另一干净的带玻塞试管中，加人2mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮试剂，在佛水浴中加热30 min,溶液即呈红色。 (3)冷却后加人4 mL甲苯,摇荡30s，静置片刻，取上层液至10 mL离心管中，在3000 r/min下离心5 min。 (4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色,求得吸光度值。四、结果计算 根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2 mL测定液中脯氨酸的含量(ug/mL),然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下: 单位鲜重样品的脯氨酸含量=52x106样重100% 实验8-12丙二醛的测定实验原理 植物器官在逆境条件下或衰老时，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是其产物之一,通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。 在酸性和高温的条件下，丙二醛可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的3，5，5-三甲基噁唑-2，4-二酮，在532nm处有最大吸收波长。但该反应会受到可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532 am处也有吸收，但其最大吸收波长在450 nm处。 植物在经受逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定中需排除可溶性糖的干扰，通常加人低浓度Fe+ (使其终浓度为0.5 nmol/L.植物组织中铁的含量一般为100300 ug/g干重)，以显著增加TBA与糖的显色反应产物在450 am处的吸收。 采用双组分分光光度法可分别求出MDA和可溶性糖的含量。该法针对混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算出一种组分由于另一种组分存在时对OD值的影响，最后分别得到两种组分的含量。器材与试剂1. 实验仪器 分光光度计，离心机，研磨器，恒温水浴锅，具塞试管。2. 实验试剂 三氯乙酸，石英砂， 硫代巴比妥酸(TBA)溶液(用10% TCA配制0.6%的TBA溶液)。3. 实验材料 盆栽小麦。实验步骤 1.MDA的提取 盆栽小麦在抽德期停止浇水，进行干旱处理，取叶片1g将其剪碎，加入10%三氯乙酸(TCA)2mL和少量石英砂，研磨；进一步加人8mL TCA充分研磨，匀浆液以4000g离心10 min,上清液即为样品提取液。 2.显色反应及测定 吸取2mL提取液，加人2mL0.6% TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷却，离心。取上清液测定332mm和450 nm处的OD值。对照管以2ml水代替提取液。 3.计算 MDA与TBA反应产物的最大吸收峰在532 nm.TBA与可溶性糖(以蔗糖为例）的反应产物的最大吸收峰在450nm吸收曲线彼此又有重叠。得到方程： C2=6.4510-6A532-0.5610-6A450 根据公式即可计算样品提取液中MDA的含量，然后再计算每克样品中MDA的含量。实验3-3叶绿素a、叶绿素b含量测定【实验原理】如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert -Beer 定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对OD值的影响，最后分别得到两种组分的含量。叶绿素a的最大吸收峰在663 nm,叶绿素b在645 nm,吸收曲线彼此又有重叠。根据Lambert -Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的质量浓度与光密度OD(A)之间有如下的关系:a=12.7A663-2.69A645b=22.9A645-4.68A663T=a+b=8.02A663+20.21A645式中T为总叶绿素质量浓度，单位是mg/L。利用上面公式，即可计算出叶绿素a和叶绿素b及总叶绿素的质量浓度(mg/L)。【器材与试剂】 1.实验仪器 高级型分光光度计 ，离心机，台天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管。 2.实验试剂 丙酮, CaCO3。 3. 实验材料 植物叶片。【实验步骤】 1. 色素的提取 取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5 g放人研钵中加纯丙酮5 mL，少许CaCO和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5mL,将匀浆转人离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，并转入离心管,离心后弃沉淀， 上清液用80%丙酮定容至20 mL。 2. 测定OD值 取上述色素提取液1 mL,加80%丙酮4 mL稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663 nm、645 nm处的OD值。 3.计算 按公式分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b的浓度。再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。 【注意事项】 1.由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。 2.由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。 过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。（1）试剂配制： 0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 61.0 mL和B母液(NaH2PO4) 39.0 mL混合后至100mL。(加1gPVP)（2）反应液配制：吸取5.68mL30%的H2O2（原液）稀释至1000mL，摇匀即可。（3）样品测定：1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入23ml 4下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将容量瓶置4冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4下保存备用. 2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管（加入酶液后在沸水中煮沸5-10min，冷却之后加入H2O2测定吸光值），按表40-2顺序加入试剂。表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管号粗酶液(ml)pH7.8磷酸(ml)蒸馏水(ml)S10.21.51.0S20.21.51.0S30.21.51.025预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。调零用磷酸缓冲液（pH=7.8）3.结果计算： 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。过氧化氢酶活性(u/g/min)= A240Vt/0.1V1tFW式中 A240 = AS0 （AS1+AS2）/2；AS0加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1, AS2样品管吸光值；Vt粗酶提取液总体积（ml）；V1测定用粗酶液体积（ml）；FW样品鲜重（g）；0.1A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t加过氧化氢到最后一次读数时间（min） 植物抗逆性的测定(电导仪法)一、原理植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。在正常情况下，组胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，如高温或低温，干旱、盐渍、病原菌侵染后,细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质