基因克隆的质粒载体

第四章基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的不同菌株中发现了许多不同类型的质粒，其中对F质粒、R质粒和Col质粒进行了详细的研究。(1) F质粒也称为因子F或性质粒。它们可以将宿主染色体上的基因与F质粒一起转移到受体细胞，而该质粒最初并不存在。R质粒通常被称为耐药因子。它们编码一个或多个抗生素抗性基因，并且通常可以将这种抗性转移到缺乏质粒的合适受体细胞，从而后者也可以获得相同的抗生素抗性能力。(3) Col质粒是产生粘菌素的所谓因子。它们编码控制粘菌素合成的基因。大肠杆菌是一种无需Col质粒就能杀死密切相关菌株的蛋白质。第1节质粒的一般生物学特征一、质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一种遗传成分，独立于染色体自主复制。大多数质粒是由环状双DNA组成的复制子(图4-1)。质粒DNA分子可以在染色体外持续稳定地处于自由状态，但在某些条件下，它们可以可逆地整合到宿主染色体中，与染色体复制一起复制，并通过细胞分裂传递给后代。环状双链质粒DNA分子有三种不同的构型：1.当它的两条多核苷酸链都保持完整的环状结构时，它被称为共价闭合环状DNA。这种DNA通常呈现超螺旋结构。2.如果两条多核苷酸链中只有一条保持完整的环状结构，而另一条链有一个或多个缺口，则称之为开环DNA(ocDNA)，即OC构型。3.如果质粒DNA被合适的核酸内切酶切割，双链断裂形成线性分子(IDNA)，通常称为l构型(见图4-2)。在琼脂糖凝胶电泳中，尽管分子量相同，但具有不同构型的相同质粒DNA具有不同的电泳迁移准备度。其中，超临界流体DNA处于领先地位，其次是超临界流体DNA和超临界流体DNA(图4-3)。所有被修饰以适合作为基因克隆载体的质粒DNA分子必须包括以下三种常见成分，即复制因子、选择性转录和克隆位点。二。质粒编码的表型质粒DNA仅占细胞染色体组的1% 3%，但它编码一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中，抗生素耐药性是质粒最重要的编码特征之一。三。质粒DNA的转移(1)质粒类型革兰氏阴性菌的质粒可分为两种类型：接合型和非接合型。接合质粒，也称为自转移质粒。它们不仅拥有自主复制所需的遗传信息，还拥有一组控制细菌配对、质粒接合和转移的基因。非结合质粒也称为不能自我转移的质粒。尽管它们有自我复制的基因信息，但它们已经失去了控制细胞排列和连接转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。(2)F质粒也称为因子F，是生育因子的缩写，是在一些大肠杆菌细胞中发现的最具代表性的单拷贝接合质粒之一。质粒以三种不同的方式存在：(1)F细胞：以染色体外环状双链质粒DNA的形式存在，没有任何来自宿主染色体的基因或DNA片段。(ii)F细胞：以染色体外环状双链质粒DNA的形式存在，并在其上携带细菌染色体基因或DN片段。(三)Hfr细胞(高频重组细胞):以线性DNA的形式从不同位点整合到宿主染色体中。因子F是男性的决定因素，所以F细胞也称为男性细胞，相应的F细胞称为女性细胞。F细胞的表面可以形成一种叫做毛的结构，促进雄性细胞和雌性细胞的配对。在适当的条件下，雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，将形成雌雄细胞配对。我们称这种过度生长为细菌结合。配对后，F受体细胞获得F因子，成为F细胞。通过将因子F整合到染色体中形成的Hfr细胞可能导致宿主染色体的高频转移。这是一个可逆的过程。在某些条件下，Hfr细胞可以再次变成F或F细胞。质粒的主要类型如表4-1所示。(3)质粒DNA的接合和转移(1)在形成细胞配对的雄性细胞的性须顶部接触受体细胞的表面后，它将迅速收缩，将供体细胞和受体细胞拉在一起。因此，性在成对的细胞表面之间建立密切接触中必须发挥重要作用。然而，大肠杆菌雄性细胞不会与其他携带F质粒的细胞配对，因为tRA和tTRA编码“表面排斥”蛋白，阻止这些细胞成为接合受体。这决定了雄性细胞只能与没有F因子的雌性细胞配对的特异性。质粒DNA转移F质粒DNA转移从转移起点oriT开始。当配对的细胞对建立时，首先在oriT位点用单链切割托盘和TraI蛋白，然后在其自由5端的引导下将有缺口的链转移到受体细胞，并用作模板合成互补链以形成新的质粒分子。然后受体细胞转化为具有因子f的雄性细胞，如图4-4所示。四.质粒DNA的迁移非结合质粒不能从多个来源转移，因为它们的分子小到足以编码转移系统所需的所有基因。然而，如果宿主细胞中有接合质粒，它们通常可以被转移。由共存的结合质粒引起的转移非结合质粒的过程称为质粒移动。ColE1是一种可迁移的质粒，但属于非结合型。质粒编码的两个基因需要参与。一个是特定的站点bom位于ColE1基因上。另一种是ColE1质粒特有的分散基因产物，即由动员基因编码的核酸酶。根据图4-5中的实验结果得出结论，mob基因和bom基因参与ColE1质粒的迁移。相容的两个质粒F和大肠杆菌1共存于同一细菌细胞中。F质粒可以提供缺乏结合功能的大肠杆菌1质粒，从而使大肠杆菌1质粒能够转移。图4-5(a)显示了位于F细胞中的ColE1质粒的形状。其mob基因已被转录，其产物导致bom位点的单链断裂，导致刻痕。ColE1 DNA随后从超转化结构转化为有缺口的环状结构。然而，ColE1质粒缺乏形成须状物的能力，并且不能进行结合和配对，因此其DNA不能从一个细胞转移到另一个细胞。正因为不能发生转移，所以从超螺旋到凹口环构型的过渡过程可以恢复，所以在两种构型之间出现平衡状态。图4-5(b)中的细胞包含f和ColE1质粒。因子F可以导致性胡须的合成，为DNA转移提供一个转移装置，因此ColE1可以被转移。然而，当F质粒提供的转移装置被分离时，ColE1的mob-突变体不能被转移。遗传分析证明暴民突变是隐性的，暴民基因编码一种蛋白质。此外，当突变质粒被分离时，它并不作为松弛的复合物存在。如图4-5(c)所示，f质粒不能帮助转移mob-突变体。尽管f须和转移装置已经形成，ColE1的DNA还没有被切割。图4-5(d)显示了另一个具有mob表型和顺式显性突变的ColE1突变体，其缺少bom位点。在这种宿主细胞中，尽管mob蛋白可以合成，但它们不能转移，因为不能出现间隙。质粒DNA的复制类型根据宿主细胞中包含的拷贝数，质粒可分为两种不同的复制类型：一种是低拷贝数质粒，每个宿主细胞只包含1-3个拷贝，我们称这种类型的质粒为“严格质粒”复制控制；另一种是拷贝数高的质粒，每个宿主细胞中拷贝数可高达10 60个。这种质粒被称为“松弛的”复制控制质粒。质粒拷贝数是指在标准培养基条件下每个细菌细胞中包含的质粒DNA分子数。表4-3列出了几种常见质粒复制基因的特征。表4-2列出了几种常见质粒复制基因的特征。六.质粒的不相容性(1)质粒的不相容性所谓质粒的不相容性，有时也称为不相容性，是指两个密切相关的质粒在没有选择压力的情况下不能在同一宿主细胞系中稳定共存的现象。在细胞增殖的过程中，其中一个会逐渐被排斥(稀释)。这两种质粒被称为不相容质粒(图4-6)。不相容组是指相互关联但不相容的质粒。(2)质粒不相容性的分子基础质粒不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰。大多数质粒产生一种抑制蛋白来控制质粒复制，其浓度与质粒的拷贝数成正比。阻遏蛋白通过与其靶序列的相互作用来断裂双链DNA的一条链，从而导致质粒DNA复制的启动并建立调节质粒拷贝数的负反馈环。当质粒面对高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活性被抑制。然而，当质粒处于低拷贝和低阻遏蛋白浓度的条件下时，其复制反应将继续。每个质粒复制速率的拷贝数控制由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白的总浓度共同控制。作为这种交叉抑制的结果，细胞中质粒的拷贝数比单独感染状态下的正常拷贝数低得多。如何阅读和分析质粒图谱有两种主要类型的载体，病毒的和非病毒的，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。合格质粒的成分1.复制启动站点Ori是控制复制启动的站点。原核生物的DNA分子只有一个复制起点。然而，真核生物的DNA分子有多个复制起始位点。2.抗生素抗性基因很容易被检测到，如Amp，Kan3.具有多个克隆位点MCS克隆携带外源基因片段4.磷/磷启动子/增强子5.终止信号6.加入多聚腺苷酸信号可以稳定基因表达如何阅读质粒图谱第一步：首先观察Ori的位置，了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)穿梭质粒是指一类人工构建的质粒载体，其具有两种不同的复制起点和选择标记，因此可以在两种不同的宿主群体中存活和复制。这一概念不仅适用于不同的微生物群落，也可扩展到真核表达载体的构建，如干草的pBE2、酵母的pPIC9K、植物细胞的哺乳动物表达载体pMT2和钛质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制和扩增，还可以在相应的干草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这有利于质粒的分子生物学操作和大量制备。第二步：再次查看筛选标记，如抗性，并决定使用什么筛选标记。1.Ampr水解-内酰胺环以减轻氨苄青霉素的毒性。2.河豚可以阻止四环素进入细胞。3.camr生成氯霉素羟基乙酰衍生物，使其失去毒性。4.新氨基糖苷磷酸转移酶灭活G418(卡那霉素衍生物)5.hygr灭活潮霉素。步骤3:观察多个克隆位点。它有多个限制性内切酶单切点。以便于外源基因的插入。如果外源基因被插入这些位点之外，一些标记基因将被失活，这便于筛选。决定是否以及如何放置目标基因。第四步：再看看外源基因的大小。质粒通常只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。步骤5:是否有表达系统的元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这用于区分克隆载体和表达载体。一些与表达调控相关的元件被添加到克隆载体中成为表达载体。载体的选择应基于实验目的。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号1.启动子促进DNA转录的DNA序列。这个DNA区域通常位于基因或操纵子编码序列的上游。它是能特异性结合核糖核酸分子并开始转录的脱氧核糖核酸分子上的位点，但启动子本身不被转录。2.增强子/沉默子-真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种调节序列，可增强邻近基因的转录。它的功能与增强子的位置或方向无关。即可以在受调控基因的上游或下游发挥作用。/消音器-阴性增强子，阴性调节序列。3.核糖体结合位点/起始编码/序列：核糖核酸有核糖体4。转录终止序列(