肺癌个体化检测及质控

上海交通大学附属上海市胸科医院 病理科 张杰,肺癌个体化检测及质量控制,9345例手术切除肺癌标本分析,Female 2761 cases,male 6584 cases,29.5%,70.5%,1 : 2.38,2004 WHO Lung Cancer Classification,腺癌,大细胞癌,鳞癌,腺鳞癌,其它,肺癌的WHO组织学分类（2004年）,浸润前病变 非典型腺瘤性增生 原位腺癌（3cm原来的BAC） 非黏液性 黏液性 黏液/非黏液混合性微浸润性腺癌（3cm贴壁状为主的肿瘤，浸润灶5mm） 非黏液性 黏液性 黏液/非黏液混合性浸润性腺癌 贴壁状为主（原来的非黏液性BAC生长方式，浸润灶5mm） 腺泡性为主 乳头状为主 微乳头状为主 实性为主伴有黏液产物 浸润 性腺癌变型 : 浸润性黏液腺癌（原来的黏液性BAC） 胶样型 胎儿型（低度和高度恶性） 肠型,肺腺癌的IASLC/ATS/ERS分（2011年）,小活检和/或细胞学标本难以进一步分型，通常诊断为非特指性NSCLC（NSCLC-NOS）提出借助于免疫组织化学（TTF-1、p63(p40)等）尽可能将NSCLC区分为倾向腺癌和倾向鳞状细胞癌，以提供药物治疗的选择肺腺癌对多靶点抗叶酸药物培美曲赛（pemetrexed）和抗血管内皮生成药物贝伐单抗（bevacizumab）治疗有效，而鳞状细胞癌对培美曲赛治疗效果不如腺癌，用贝伐单抗治疗可引起威胁生命的大出血,小活检和细胞学诊断肺癌,TTF-1,鳞癌? 腺癌?,鳞癌? 腺癌?,P63(p40),小活检和细胞学标本除用于病理诊断外，要适当留存一些标本做分子检测（基因突变、扩增和染色体易位等）新分类还推荐如有可能，细胞学检查最好与小活检细胞学检测一起进行，以提高诊断准确性细胞学是一个有用的诊断方法，尤其是和组织学相结合时从细胞穿刺或胸腹水标本中保存细胞包埋块（cell block)，用于分子检测,小活检和细胞学诊断肺癌,2011年NCCN非小细胞肺癌治疗指南（中文版）,2012 NCCN指南推荐所有NSCLC患者进行检测 中国版NCCN指南与美国版NCCN指南的区别：除了腺癌、大细胞癌和未分类的NSCLC患者，中国版NCCN指南要求鳞癌也要进行EGFR突变检测,2013 NCCN指南推荐更新，EGFR检测更为重要,2013NCCN指南与既往不同在于：未知人群减少，腺癌/大细胞癌患者均需要做检测为I类证据/不吸烟鳞癌也可以EGFR突变检测,卫生部原发性肺癌诊疗规范（2011）,Nature Review 2007, 7:169,非小细胞肺癌中药敏相关的EGFR突变,外显子19，21突变为常见EGFR敏感突变类型,Dacic S. Adv Anat Pathol 2008; 15:241-247.Riely GJ, et al. Clin Cancer Res 2006; 12(24):7232-7241.Murray S, et al. J Thorac Oncol 2008; 3:832-839.,肺癌与EGFR,目前国内开展EGFR检测的单位逐渐增多有关中国人EGFR基因突变研究的报道增多2011年中华病理学杂志发表了“关于EGFR突变检测共识”2011年11月15日1成立卫生部分子病理质控中心,(中华病理学杂志 2011年10期）,(中华病理学杂志 2011年10期）,EML4-ALK检测：方法概述,荧光原位杂交 (FISH),逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR),期临床结果再回顾,三种检测方法比较,FISH、IHC和RT-PCR比较参数表,Adapted from Mitsudomi, IASLC 2011; Abs #MTE22.1Hirsch, IASLC 2011; Abs #O05.08,ROS1基因与NSCLC,ROS1基因位于6号染色体长臂22（6q22）共有43外显子其mRNA全长7638bp,ROS受体酪氨酸激酶的靶向治疗原理,FN-III like repeats,TK domain,ROS在脑、肺、胃、乳腺和肝肿瘤/细胞系中的过表达在结肠癌和肾癌细胞系中ROS 突变肿瘤中发现的ROS 融合FIG-ROS：恶性胶质瘤细胞系SCL34A2-ROS: 非小细胞肺癌细胞系CD74-ROS: 非小细胞肺癌患者克唑替尼可抑制ROS 融合基因细胞系的 生长,Structure of ROS,El-Deeb et al., Med Res Rev. 2010 epub,克唑替尼: 概述,名称: PF-02341066通用名: 克唑替尼商品名: XALKORITM化学式: C21H22Cl2FN5O作用机制: 竞争性ATP 抑制剂主要靶点: ALK、c-Met、ROS2011年8月26日美国FDA批准用于ALK阳性非小细胞肺癌,克唑替尼在ALK ATP结合部位,Pfizer, data on file,ROS1基因重排,ROS1的重排成为了一种继成功发现肺癌突变基因KRAS（占25%）、EGFR（占10-15%）、ALK（占4%）后，再一次发现最新的肺癌基因突变ROS1。ROS1基因突变的癌症患者常见于年龄偏小，不吸烟，病理类型为腺癌的肺癌。由ROS1基因重新排列引起的癌症在非小细胞肺癌中占1%。ROS1重排可引起癌基因ROS1融合激酶的表达及对ROS激酶抑制剂敏感性。Crizotinib作为C-MET、ALK及ROS的小分子酪氨酸激酶抑制剂可能成为进展期非小细胞肺癌有效治疗药物。该药物已经获准用于局部进展期和转移性ALK阳性的非小细胞肺癌患者的治疗。,分子靶向基因检测质量问题,实验室： 达标人员资质标准化 检测人员上岗培训、上岗证书 报告签发人员资质、分子病理医师 实验条件；检测方法：方法越是灵敏，抗污染的问题越是突出 标本来源：不同的标本，应相对采用不同的检测方法,分子病理实验室质量要求,二. PCR实验室要达标，通过国家验证 检测结果要做室间比对 国际间的室间比对 ( EMQN, ESP, ETOP and ESMO)分子病理实验室要通过ISO15189认可,临床标本与研究标本的差异,分子检测与靶向治疗的关键步骤,分子检测与靶向治疗的关键步骤,标本来源 手术切除标本气管镜活检标本经皮穿刺标本淋巴结穿刺标本胸水/心包 细胞学标本血清DNA标本及循环细胞,标本相关问题标本异质性标本类型标本的收集和储存,标本是获得高质量检测结果的重要前提,常用标本获取方法,CT引导下肺穿刺活检模拟气管镜引导下经支气管镜肺组织活检(VB-TBLB)经气管镜超声引导下活检 (EBUS)锁骨上淋巴结穿刺活检胸腔闭式引流术心包穿刺术外科开胸手术活检胸腔镜活检纵隔镜活检微创手术活检,取样中存在的问题,肿瘤的位置肿瘤生长的部位有时难以进行内科穿刺活检，需要依靠外科手术活检取材细针穿刺时使用的器材尺寸可能影响细胞的获取量及DNA的质量由于无法保证每次都能取得足够的标本，需要一些适用于小标本的检测方法,肿瘤标本获取的主要途径,手术(切除/切取),支气管镜(活检：中央型),穿刺(活检：周围型),标本的获取,标本的获取：以穿刺为例,可行性评估根据病灶位置选择合适的穿刺手段复杂情况的处理 严重水肿基底部位呼吸动度较大部位的肿块肿块内部支气管充气征明显肿瘤内血管丰富,标本的获取,对周围型病变，TBLB创伤小，可重复性强，是一种相对安全有效的检查方法，但TBLB取材大小受器械规格限制，活检组织易受挤压变形而影响检测结果1锁骨上淋巴结穿刺活检是一种便捷有效的临床技术，检出率高，副反应小2，但仅能提供细胞学样本。EBUS可通过中央气道取的组织，诊断迅速，并发症少，是一种安全性较好的活检方法。对肺癌和其他纵膈恶性疾病诊断价值高，并可协助分期3胸腔闭式引流术和心包穿刺术并发症少，容易为患者接受，术前需行超声定位，可在超声引导或CT引导下进行4,5 。但引流获得标本需进一步富集。外科方法可获取大量、新鲜样本，但创伤较大或费用昂贵,肺癌的活检标本通常仅含有少量肿瘤细胞,如何获取优质标本：标本处理,如何获取优质的标本：标本类型,石蜡组织：尽可能送检一年内的石蜡标本石蜡切片：含肿瘤细胞越多越好(50%以上)；组织部位面积约6mm x 6mm以上包埋组织：组织块不小于0.50.50.5(cm)新鲜组织：比石蜡等处理过的旧组织，DNA保存得更完整，对PCR实验更有利，但一定要经病理学确认含有肿瘤组织50%以上；重量10g(约米粒大小以上)，经PBS或生理盐水冲洗干净取癌组织的中心位置组织块(避开坏死区域)，固定于10%中性福尔马林溶液中，尽快送病理科,要有病理学诊断只要能获得足够的癌细胞，各种取材方式均可对于复发的患者，再次活检不仅可确诊，还可以获得分子标志物的信息,如何获取优质的标本：标本类型,尽可能取得大标本进行检测临床常用的取样方法取得标本量通常较少内镜活检、穿刺活检、细胞学标本(支气管刷检, 细针穿刺) 小标本检测失败率 5366% (内镜活检与穿刺活检) ，而切除活检标本的失败率仅24% 标本中肿瘤细胞的含量也十分重要,Eberhard DA, et al. J Clin Oncol 2008; 26:983-984.,分子水平的肺癌细胞存在异质性 肿瘤内异质性 原发部位与转移部位的异质性,如何获取优质的标本：标本异质性,Eberhard DA, et al. J Clin Oncol 2008; 26:983-984.,如何获取优质的标本：标本的采集和储存,经福尔马林固定处理的标本可能存在以下问题 核酸分解片段长度缩短干扰PCR结果固定标本中可能存在序列改变,Eberhard DA, et al. J Clin Oncol 2008; 26:983-984.,如何获取优质的标本：标本含量,分子检测与靶向治疗的关键步骤,基因突变检测影响因素-方法学因素,ME-PCR/ Sequencing,O,= 产物转移/加入试剂/开管操作,qPCR: Real-timeDetection,PCR,Clean-up,Sequencing Rxn,Capillary Sequencing,PCR,PCR,Clean-up,Sequencing Rxn,CapillarySequencing,PCR,Hetero-duplex,CapillaryElectro-phoresis,ARMS & PNA-LNA clamp,PCR/ Sequencing,Nested PCR/ Sequencing,PCR/HRMA/dHPLC,PCR/RFLP,PCR,RFLP,Electro-phoresisSizing,PCR,PCR,Clean-up,Sequencing Rxn,CapillarySequencing,RFLP,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,TaqMan,Clean-up,O,Clean-up,O,Clean-up,O,O,O,O,PCR,SURVEYORcleavage,dHPLCSizing,O,Confirmation by sequencing,PCR/SURVEYOR,PCR,Clean-up,Pyro-sequencing Rxn,Pyro Sequencing,O,O,1,2,3,4,5,6,Steps,7,Confirmation by sequencing,O,Confirmation by sequencing,O,O,O,1%,10%,3-10%,10%,3-12%,2030%,2030%,1%,qPCR: Real-timeDetection,10%,直接测序法,荧光定量PCR,ARMS vs. DNA测序,中华病理学杂志 2008; 37(5):294-9.,* 肺癌手术石蜡切片标本检测EGFR基因突变* IPASS 方法学 * INTEREST方法学,ARMS vs. DNA测序,1. Dacic S. Adv Anat Pathol 2008; 15(4):241-247.2. 中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家组. 中华病理学杂志 2011; 40(10):700-702.,EGFR基因突变检测方法的选择,DNA 测序在部分地区仍然是EGFR 检测的金标准其他方法，比如ARMS可能比直接测序更敏感，目前已被广泛应用新的EGFR基因检测方法层出不穷，其检验效能有待进一步考证,优化检测途径，最大限度提高检测敏感性、降低假阳性和假阴性率以获得可靠的检测结果对每个患者来说都至关重要,关于EGFR突变检测共识（中华病理学杂志 2011年10期）,关于EGFR检测时间活检：1小时内送病理科及时固定于4%中性甲醛中小标本6-12h大标本6-48h病理报告3个工作日（包括免疫组化）EGFR 5-7个工作日总共10个工作日，完成全部诊断和检测工作,关于EGFR突变检测共识,DNA提取： PCR扩增成败最关键步骤 建议采用正规公司的DNA提取试剂盒 DNA提取质量比数量更为重要建议对提取DNA模板做质量检测OD值DNA标本质量不符质量，阳性则罢阴性要注明。组织切片中要有200-400个细胞 5-10um切片 10张,EGFR突变检测病理质控,2011年11月15日1成立卫生部分子病理质控中心非小细胞肺癌EGFR基因突变的检测共识结直