二代测序技术在医学领域中的应用PPT参考幻灯片

第二代测序技术在医学领域的应用，魏东凯，概述，第二代测序技术简介通用医学领域NGS计划石蜡包埋样品溶液CTC和ctDNA，第二代测序技术简介，人类基因组，30亿个来自母亲的碱基对，30亿个来自父亲的线粒体基因组碱基对，母亲与人类共生的微生物基因组，DNA组成，末端终止测序，ABI3700(ABI3730)，人类基因组计划(HGP)和人类基因组计划(HGP)由美国科学家于1985年首次提出并于1998年正式启动来自美国、英国、法国、德国、日本和中国的科学家共同参与了这项耗资30亿美元的人类基因组计划。根据该计划的假设，人体内大约40，000个基因的密码最终将被解开，同时人类的基因谱也将被绘制出来。换句话说，这是为了揭开构成人体40，000个基因的30亿个碱基对的秘密。人类基因组计划、曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划被称为三大科学计划。被称为生命科学的“登月计划”。CraigVenter是第一个使用330 ABI3700进行全基因组鸟枪法测序的公司，购买了当时世界第三大服务器进行计算，并花了3个月对Venter的基因组进行测序以获得20GB的数据。文特尔基因组测序，基于分子克隆，必须将DNA片段克隆到大肠杆菌中，否则测序无法进行。10ul末端反应系统的每一个末端都包含1013个DNA分子，但一次只能测试其中一个。预计将耗资2亿美元，最终达到30亿美元。我们如何减少试剂消耗？为了减少消耗，1。用聚合酶链反应(PCR)代替分子克隆，并首先在DNA片段上添加尾部。桥接PCR2。减少反应体积，将测序反应装入一个小空间。10ul的试剂可以进行更多的DNA测序反应。为了减少消耗，1。用聚合酶链反应(PCR)代替分子克隆，并首先在DNA片段上添加尾部。桥接PCR2。减少反应体积，将测序反应装入一个小空间。10ul的试剂可以进行更多的DNA测序反应。桥梁聚合酶链反应，第二代测序(NGS)，SBS，流式细胞仪，SBS技术特点，阅读长度最初只有31bp，现在可以达到600bp。如果操作时间长，荧光信号将逐渐减弱。一次只能结合一个碱基来发射荧光信号。海信q2500可同时运行两个8通道流动池，有两种模式：高通量模式和快速模式。单次操作的数据量高达500GB。快速模式的最小运行时间为17小时。NGS方案在普通医学领域，第二代测序应用于医疗的可行性，NGS的优势，与第一代测序相比，NGS更省时、成本低、速度快、覆盖面深、准确度高；高通量测序的人类基因组有助于发现与疾病相关的未知基因。对于疾病引起的基因突变，高通量测序可以为患者医生提供更准确的诊断依据。需求样本类型广泛，对样本大小的需求较小。NGS计划在普通医学领域，全基因组重测序(WGRS)发现个体突变，InDel，CNV，SV等。需要大量数据，单个样本需要90G数据。全外显子测序(WES)捕获基因组中的所有外显子进行测序，测序数据量远少于WGRS，并且可以获得高测序深度(50X-150X)。NGS计划在普通医学领域，目标测序捕获和丰富感兴趣的目标区域测序，技术过程类似于完全外显子捕获，测序需求少于WES。可以获得更高的测序深度(高达500倍)的转录组测序(RNA-Seq)，以研究转录水平上的测序，包括信使核糖核酸、核糖核酸、微核糖核酸等。全基因组测序是一种对基因组序列已知的个体的基因组进行测序并分析个体或群体水平差异的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病致病突变的研究已经从外显子区域扩展到整个基因组。通过构建不同长度的插入文库和短序列与双端测序相结合的策略进行高通量测序，获得常见、低频率甚至罕见的突变位点和结构变异，全基因组重测序(WGRS/DNA序列)，单核苷酸多态性(个体差异)，CNV(大片段基因拷贝数变异)，结构变异，全基因组重测序的应用，单核苷酸多态性(SNV)，例如，为什么研究单核苷酸多态性？单核苷酸多态性被认为是疾病发生的基因分子标记。单核苷酸多态性被认为是导致药物分化的主要因素之一，因此可以根据单核苷酸多态性的变化进行个性化用药。单核苷酸多态性分布广泛且相对稳定。一些单核苷酸多态性会直接影响功能基因的表达。大多数单核苷酸多态性是无用的，大多数单核苷酸多态性是沉默突变。非编码区的错义突变不会导致蛋白质变化。但也有例外。诊断示例：詹姆森博士和约瑟夫德里西合作从一名患有迷魂药的垂死少年的脑脊液中提取核酸样本。测量了800万个核酸序列，检测了475个钩端螺旋体序列，从而确定该男孩的疾病是由钩端螺旋体感染引起的。根据上述判断，詹姆斯格伦医生用青霉素治疗了这个男孩，并治愈了他。脑脊液是一种很难获得的体液，只能少量收集，这限制了可以获得的核酸总量。钩端螺旋体在病原体的常见程度排名中是一个较低的物种。在这种情况下，如果用聚合酶链反应逐个筛选病原体，在钩端螺旋体排出之前，核酸可能不够。但是高通量测序克服了核酸不足的问题。在这种情况下，钩端螺旋体的DNA只占总DNA的0.6万，含量很少。然而，通过高通量测序获得了475段钩端螺旋体DNA，这使得钩端螺旋体无处可寻。当H1N1病毒在2009年爆发时，一名患者死于呼吸系统引起的多器官衰竭，但具体的死亡原因尚不清楚。科学家利用病人肺部穿刺组织的DNA进行高通量测序。最终，950万个序列中的0.85%来自H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发现病人死亡的真正原因。在人类基因组高度干扰的背景下，其他技术很难快速找到致病病毒序列和分子分型。黑田，男，Katano，h .Nakajima，n .Tobiume，m .Ainai，a .Sekizuka，t .Sata，T.(2010).PloSOne，5(4)，e 10256 . doi :10.1371/journal . pone . 0010256，Nimble Gen(Roche)SureSelect(Agilent)RNALOGULTRUST(Illumina)，全外显子测序(WES)，癌症相关(人类)遗传疾病(人类)和其他非传染性疾病(人类)主要用于发现罕见突变，基因突变和癌症相关体细胞突变可通过SNP和InDel进行分析，但由于捕获区域较短，它们通常不用于CNV和WES应用领域，成本低(一般50-150倍，也只需要8-15G数据)减少了分析背景，容易发现罕见的突变。可以检测到大约50-80bp的片段缺失。由于外显子捕获芯片片段较短，很难判断它是由捕获缺失还是缺失引起的。类似地，通常不执行CNV和奇异值分析，因为捕获的码片片段很短。水环境系统特征，水环境系统方案流程，包括基因序列，基因序列，sRNA序列等。可以高通量地分析转录物信息，并且可以找到未知的转录物和基因注释。寻找个体之间、同一个体在不同时期等感兴趣的基因表达丰度的变化。转录组测序(RNA-Seq)，信使核糖核酸-Seq方案，一些关于非编码核糖核酸的知识，长度大于200 BP的非编码核糖核酸不能编码蛋白质，包括内含子区和外显子区具有调节基因表达的功能，如对染色体结构的影响，对核糖核酸加工修饰和稳定性的影响，对转录和翻译的影响，甚至对蛋白质转运和稳定性的影响。因此，近年来，许多对核糖核酸序列进行测序和分析的文章包括对低核核糖核酸的分析，并且发现了许多新的低核核糖核酸。寡核苷酸序列、sRNA序列、核糖核酸序列的优点不限于已知的基因组序列信息。与芯片技术相比，适用于未知基因组序列物种的高通量转录组研究背景信号值低，没有检测上限，基因表达谱的检测范围非常宽。在内参条件下，在定量方面表现出较高的准确性和重复性。不需要克隆步骤，操作简单，所需样品量小，用于单细胞水平的表达谱分析的产量高，成本低于Tillingarray或大规模EST测序。RNA-seq的挑战，大片段RNA在文库构建过程中必须是片段化的，会引入一定的偏见。聚合酶链反应可以引起表达的变化。大量短序列数据的比对或拼接非常复杂，重复序列和多个匹配序列的精确定位存在明显的问题。高等真核生物的选择性剪接和反式剪接的鉴定之间仍有相当大的误差。测序深度的确定因物种、器官、组织和时期而异，很难有一个统一的公式来直接计算。石蜡包埋样品溶液、FFPE样品(石蜡包埋切片组织)和石蜡包埋技术(福尔马林固定和包埋，FFPE)是临床实践中最常见的DNA保存方法。全世界医院中超过80%的珍贵临床样本都是通过这种技术保存下来的。然而，由于DNA分子通过福尔马林浸泡被交联和酶促修饰，所以DNA被不同程度地降解。样本量很大。80%以上的临床样本被包埋在石蜡中，许多珍贵的临床样本已经过组织学和病理学研究。很容易完成相关的实验验证。为什么需要使用难以提取的FFPE样品。福尔马林处理的DNA易于交联，这使得提取的DNA的量低，提取的DNA的质量低。200bp-5kb的降解程度通常与石蜡包埋时间有关。FFPE-韦斯的最大挑战是是否有相同的突变？目前，它不能在WGRS使用。样品降解严重，对DNA覆盖率有很大影响。脱氧核糖核酸的数量太少，质量很差。石蜡包埋时间越长，福尔马林对DNA的交联和损伤越大。未经保护性缓冲液处理的福尔马林影响更大。FFPE的样本仍然有问题，CTCS和ctDNA，什么是CTCs？循环肿瘤细胞是指由于诊断和治疗操作而自发或通过实体瘤或转移灶释放到外周血液循环中的肿瘤细胞。四氯化碳是肿瘤转移过程中在血液循环系统中存活的肿瘤细胞，四氯化碳的产生被认为是肿瘤转移的必要前提。四氯化碳研究的重要性，四氯化碳研究的困难，四氯化碳没有显著的特异性，与其他血细胞明显不同，不同组织学类型和分子表型的肿瘤分别表达不同的标志物。四氯化碳在外周血中很少见，通常只含有106-107个白细胞中的一个。CTCs的富集，通过细胞形态富集、微流控芯片、密度梯度离心、血浆a:血浆单核细胞：单核细胞(包括淋巴细胞、单核细胞、上皮细胞和肿瘤细胞)Ficoll:密度梯度液体红细胞：红细胞、免疫磁珠富集法、微流控、CTCs鉴定、流式细胞术分析(FLOW CYTECHNOLOGIC)和免疫细胞化学技术ICC(免疫细胞化学)鉴定样品中细胞的抗原性和形态特征，使富集的靶细胞能够维持细胞形态并维持细胞活力。ICC是一种通过在能够与显色剂结合的单克隆抗体与CTCs特异性结合后，用显色剂显色来鉴别CTCs的技术。可以通过分析上皮细胞或肿瘤细胞的正常来源组织特异性的候选基因的表达来检测CTC。灵敏度非常高的癌细胞，但是坏死和上皮细胞污染都会导致假阳性结果。该方法不能检测CTCs细胞形态，在临