移植排斥反应.ppt

移植免疫及相关问题探讨瑞金医院检验科顾志冬,免疫排斥与器官移植相关检验技术,移植(transplantation):指用自体或异体的正常细胞、组织或器官置换病变的或功能缺损的细胞、组织与器官，以维持和重建机体生理功能的治疗方法。供者（donor）受者（recipient）移植物（graft）移植排斥反应（graftrejection）,目的：救治末期器官衰竭、恶性血液病、肿瘤以及某些遗传病。要求：尽可能让移植物能在受体体内生存或暂存常时间。困惑：排斥反应、继发感染。策略“immunotolerance”（免疫耐受），监测和预防。,免疫排斥（immunerejection）：指器官、组织或细胞移植后，受体发生免疫应答，引起针对移植物的免疫损伤而使其丧失功能的一个过程。表现：hyperacuterejectionacuterejectionchronicrejection,移植类型：1、autologoustransplantation自身移植2、syngeneictransplantation同系移植3、allogeneictransplantation同种异体、异基因移植4、xenogeneictransplantation异种移植根据移植物所植部位原位异位,主要内容,一、免疫排斥反应发生的机制二、移植排斥反应的类型三、移植中的组织配型四、移植排斥的免疫学防治五、干细胞移植六、移植排斥的特殊免疫学问题七、排斥反应的免疫学检验八、移植后药物浓度的检测,一、免疫排斥反应发生的机制,（一）移植抗原（transplantationantigen）1、主要组织相容性抗原（majorhistocompatibilityantigen，MHA）又人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）2、次要组织相容性抗原（minorhistocompatibilityantigen，mHA）3、其他同种异型抗原（血型、不同组织特异性抗原）,1、主要组织相容性抗原（MHA）：一组存在于各种脊椎动物某对染色体特定区域的基因群，其编码的基因产物分布于各种有核细胞的表面，为重要的细胞膜抗原，也称之主要组织相容性复合体（MHC）。人和脊椎动物都有各自独特的MHA。除小鼠和大鼠有专门命名外，其他种属的MHA均称白细胞抗原（leukocyteantigen，LA）。（Humanleukocyteantigen，HLA）,HLA：位于人类的第6对染色体的短臂上，由400万个碱基组成，分、类（复杂）。例HLA类基因：HLA-A,-B,-C和-E-H,-X;HLA类基因：HLA-DP,-DQ,-DR和-DN-DOHLA类基因：位于HLA-和的之间。关于HLA、类分子的结构（略）。关于HLA分型、应用与鉴定（后叙）。,（二）T细胞识别同种异型抗原的机制,直接识别间接识别同种异型抗原的直接识别和间接识别,直接识别（directrecognition）：指受者T细胞直接识别供者抗原递呈细胞表面的MHC分子等。（急性、反应强）间接识别（indirectrecognition）：指受者T细胞识别经过受者抗原递呈细胞加工处理的来源供者MHC分子的肽。（慢性、弱）directrecognition对环孢素敏感indirectrecognition对环孢素不敏感,（三）移植排斥反应的效应机制,1、超急性排斥反应：时间：几分、几时48小时发生机制：预存于受体的抗移植物抗体随血流进入移植物，通过与血管内皮细胞结合，激发一系列免疫损伤应答。过程：补体活化-血小板黏附聚集-凝血系统活化-血栓形成-缺血性坏死血型不符、多次妊娠、反复输血、移植过,2、急性排斥反应：时间：数周数月内机制：残留于供体移植物中的APC对受体的免疫系统提供最初的抗原性刺激，激活免疫应答（directpath）通过受体的APC对移植物抗原的识别后，再刺激并激活免疫应答反应（indirectpath）分类：急性体液排斥反应/急性细胞排斥反应,1）急性体液排斥反应：（急性脉管排斥反应），主要由抗内皮细胞表面HLA分子的抗体所介导，不引起血栓，出现移植组织和器官的血管炎。对免疫移植剂治疗无效，被迫切除移植物。2）急性细胞排斥反应：（加速性细胞排斥反应），发生此类反应患者的血液中，可以有抗供者的抗体，但不一定引发急性脉管排斥反应，却以移植组织或器官实质性损害、坏死为主，伴淋巴细胞侵润。（CD8+CTL的细胞毒作用等）,3、慢性排斥反应：时间：术后数月数年机制：与免疫相关系急排发作致移植物退行性变，由迟发超敏反应介导的免疫炎症。非免疫相关局部缺血、微生物感染,二、移植排斥反应的类型,HVGR（hostversusgraftreaction）GVHR（graftversushostreaction）HVGR指宿主对移植物攻击，排斥GVHR指移植物中的过路T细胞对宿主攻击，排斥临床上HVGR多见。,HVGR：,（一）超急性排斥反应（48小时）受者体内预存针对移植物抗体（二）急性排斥反应（几天2周）CD4+Th1介导的超敏反应，CD8+CTL毒性受体产生抗移植物抗体；NK、M激活（三）慢性排斥反应（数周、月、年）未明了，与上述免疫学机制有关；有非特异性免疫学机制参与（感染、并发症等）,GVHR（GVHD）,发生的前提：受、供者HLA型不匹配，移植物中存在足够量的免疫细胞（成熟T），受者免疫无能或极低。移植物抗宿主反应导致移植物抗宿主病，临床表现为急性/慢性，难以逆转死亡率高T细胞是介导GVHR的主要效应细胞，去除骨髓中成熟T细胞有效预防GVHR的发生。,三、移植中的组织配型,（一）选择组织相匹配的供者1、一般情况（供物状态、全身情况、年龄）2、ABO血型相容（拟输血）3、HLA相容性（受、供者HLA等位基因相合的数目越多越好）（二）HLA相容程度测试1、血清学分型2、细胞学分型3、基因分型,1、血清学分型：原理利用各种已知的HLA标准血清型，与检测细胞反应，添加补体后观察细胞反应（CDC）（micro-complementdependentcytotoxicity）技术要点分离淋巴细胞，与标准抗血清反应，添加补体，死细胞染色记数、判断评价较理想，标准抗血清难,2、细胞学分型采用淋巴细胞混合培养（MLC），分双向/单向。双向MLC受、供体淋巴细胞混合体外培养，彼此作用，观察细胞形态与细胞增殖，互不影响示受、供体间HLA型相匹配，否则技术要点分离计数彼此淋巴细胞，共孵育，染色计数转化细胞评价用于移植前的交叉配合试验，但不能判定HLA-D型,单向MLC用已处理的标准型细胞与测试细胞共孵育，观察测试细胞的反应。标准型细胞为只表达LD抗原的细胞，经丝裂霉素C或线处理失去增殖能力，作为刺激细胞，与测试细胞孵育，观察测试细胞的增殖反应，称纯合子细胞分型试验（HTC）。测试细胞无增殖反应示彼此相同，又称阴性分型试验。,当标准型细胞为只能对单倍型细胞具有识别而增殖的现处于静止状态的淋巴细胞，经预处理后成为致敏淋巴细胞（PL），作为反应细胞，与测试细胞孵育时，经测试细胞的刺激使PL转化、增殖，又称其为阳性分型试验（PLT）。HTC/PLT均为单向MLC，技术要点类同双向，但有许多预处理等。评价实际但繁琐、技术要求高,3、基因分型限制性片段长度多态性（RFLP）分型聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针（PCR-SSOP）PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）分型PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）分型PCR指纹图谱技术其他,限制性片段长度多态性（RFLP）分型：利用不同个体的HLA相应碱基序列不同，其内源性酶切位点不同，经同一组内切酶的酶切反应后，出现酶切片段的个数、长短不一（酶切图谱）。与已知型的比对、分析用以定型。,聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针（PCR-SSOP）：将待检细胞HLA基因片段经PCR扩增、产物转移至尼龙膜上，再与核素标记的特异性寡核苷酸探针进行杂交，结合完好说明其基因序列相似（互补）。,PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）分型：先设计特异性引物（SSP），因为此SSP只能和相应的等位基因特异性片段的碱基序列互补结合PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）分型：相同长度的单链DNA，其碱基顺序不同即便只有单个碱基不同，经不变性的中性聚丙烯胺凝胶电泳后，可反映不同的空间构象（泳动速度、迁移率）。,PCR指纹图谱技术：DNA指纹图是指，由于不同个体的DNA具有不同的分子构象，其在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中呈现的特异性区带图谱。操作步骤是，先分别得到供者/受者的DNA指纹图；然后将得到供者和受者的混合DNA指纹图，并作一致性比较分析,（三）交叉配型试验,目的：检测受者体内是否存在抗供者的特异性抗体以及受者对供者HLA抗原的相容程度。技术要点：供者淋巴细胞+受者血清（混合）供者淋巴细胞+受者淋巴细胞等等方法：1、微量细胞毒试验，2、流式细胞术，3、混合培养，4、CML,四、移植排斥的免疫学防治,移植排斥反应是根据临床表现、移植物功能状态、实验室多种相关检测结果的综合性判断的。移植排斥反应是移植失败的主因；是移植免疫致力克服的关键难题。关注点（一）排斥反应的监测（二）排斥反应的防治,（一）排斥反应的监测,1、细胞免疫学监测T淋巴细胞数量、功能以及亚群比例等，杀细胞活性（CTL和NK）。2、细胞因子监测：Th1型/Th2型Th1型包括IL-2、TNF-a、IFN-r等Th2型包括IL-4、IL-10等3、抗HLA抗体检测4、蛋白、酶类、补体检测,3、抗HLA抗体检测：,原理：与异体排斥反应有关的体液、细胞免疫效应主要是针对HLA抗原的，移植前所检测的包括面不够（其他抗体/群体反应性抗体(PRA)？群体反应性抗体(PRA)：是指器官移植受者体内的抗HLA（特异+其他），因为测得血清中PRA的水平更有助于移植时受者对移植物的敏感程度。移植术前后的PRA高低与术后急性排斥反应明显有关。,（二）排斥反应的防治,1、HLA配型（组织配型）2、免疫抑制剂3、移植耐受的诱导4、移植物等的预处理,1、HLA配型越接近，成功率越高。HLA配型应包括对HLA-类分子和其类分子的配型。尤其类分子的匹配与否，更关系到移植物能否长期存活问题。HLA的配型包括HLA交叉配型、预存抗体的检测。交叉配型包括淋巴细胞间、T细胞淋巴细胞毒性间、B细胞淋巴细胞毒性间、流式细胞法、自身等。,2、免疫抑制剂1）药物:皮质类固醇细胞增殖抑制剂（霉酚酸酯；MMF）抑制T细胞活化（环孢素；CsA）（普乐可复；FK605）2）抗体：抗淋巴细胞、抗胸腺细胞、抗CD3等3）输血：与活化Ts细胞、产生封闭抗体等,3、移植耐受的诱导：1）照射：X线照射（全淋巴照射-细胞破坏）紫外线照射（灭活传递细胞功能，活化Ts）2）药物：环磷酰胺、环孢霉素A等，诱导免疫耐受可能与诱导Ts细胞增生有关。3）抗体：抗淋巴细胞血清、抗T细胞表面分子抗体，使得T细胞等无能,4、移植物等的预处理1）移植物的预处理：不同组织器官的移植，其移植物的处理不尽相同（外科修整、动脉灌洗）。动脉灌洗，清除残留于待移植器官内的血液及细胞成分，尤其是免疫细胞（过客细胞），以防止过客细胞导致的GVHR。用灌洗液前例腺素E1、硫酸镁、Collins液；或添加抗体2）受体的准备（略）,五、干细胞移植,干细胞指人体中尚未发育的原始细胞，具有“树干”和“根源”的双重意义。,干细胞的定向分化,干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。体外经一定条件可使其定向分化细胞、组织、器官等。干细胞种类：胚胎指受精卵分裂发育成囊胚时的内层细胞团（全能性）。成体指成年动物中某些具再生、修复能力的干细胞。,干细胞移植的临床应用：1、作为种子细胞，用于细胞治疗或组织细胞替代治疗。2、研究胚胎发育的调控机制3、作为疾病基因治疗的理想载体4、用于药物筛选和新药开发5、催生了细胞性心肌成形术,六、移植排斥的特殊免疫学问题,指跨物种间的移植（异种移植），解决供体器官的同时，强烈的排斥反应（一）异种间移植的排斥反应1、特性：、2、类型（附图）3、预防：脾切除，阻断补体活性，吸附除去天然抗体（二）骨髓移植的排斥反应,（一）异种间移植的排斥反应,1、特性：、细胞表面“异物”更多、急性血管性排斥反应、加速性细胞排斥反应、受者体内本存抗体，可促进ADCC的发生与发展、异种间的免疫障碍大于同种2、类型（附图）,协调性(concordant):指属异种，但种属比较近的异种移植排斥；非协调性(discordant):指异种移植排斥发生在种系间较远的。根据参与反应发生的的机制不同，协调性容易型/困难型非协调性抗体介导型/补体介导型协调性与非协调性区别：前者为诱导型抗体后者为天然型抗体,3、预防：脾切除，阻断补体活性，吸附除去天然抗体,（二）骨髓移植的排斥反应,同种异基因（异体）骨髓移植用于治疗白血病、再障等，目前面临两大主要问题：1、白血病的复发2、移植物抗宿主反应（GVHR）GVHR定义（略）GVHR发生原因（略）GVHR发生机制（初）：CD4+Th1/Th2CD8+Tc1/Tc2NK、单核、粒细胞等慢性GVHR被视为一种自身免疫病。,七、排斥反应的免疫学检验,（一）体液免疫水平的检测检测指标ABO血型、其他血型、抗HLA抗体及供者组织细胞抗体、血管内皮、细胞抗体、冷凝集素抗体等。测定方法（略）,（二）细胞免疫水平检测检测指标参与细胞免疫有关的细胞数量、功能和产生细胞因子水平。检测手段外周血T细胞及其亚类的计数T细胞转化试验（4h）NK细胞活性测定血清细胞因子的测定黏附分子及其配体的检测,（三）补体水平的检测检测指标补体成分（C1q）、其裂解产物（C3a）及总补体活性（CH50）检测方法（略）（四）急性时相反应物质的检测检测指标C反应蛋白、TNF-a、IL-1、-6检测方法（略）,八、移植后药物浓度的检测,为什么要进行药物浓度监测如何进行药物浓度监测1）药物浓度监测的临床指征2）药物浓度监测的目的3）药物监测的种类与方法4）药物浓度监测的要点,治疗药物监测的临床意义,一治疗药物检测的概念治疗药物监测是指临床生化实验室通过理化方法测定病人体液中药物浓度，对病人施行个体化的治疗方案以保证较好的治疗效果和较高的安全性的一种措施。,药物浓度监测的缺点,费用昂贵影响因素复杂,需进行监测的常见药物,移植和免疫抑制剂的应用,1596年，意大利外科医生成功进行最早一次成功的自体组织移植.19世纪初，尝试异体皮肤移植,但因排斥而失败。1940年，Medewar证实了同种异体移植排斥是一种免疫现象.1954年，美国医生Murray在单卵双生姐妹间进行肾移植获得成功。1962年，应用HLA分型技术选择合适的供体，第一次用无亲缘关系的供体肾进行异体移植，获得成功。80年代初，由于环孢素A等应用，明显提高了器官移植的成功率，器官移植已广泛应用于临床。,免疫抑制剂的发展,1960年前，硫唑嘌呤1963年，去氢氢化可的松1968年，抗胸腺细胞球蛋白1978年，CSA1992年，FK5061999年，重组抗CD3阳性细胞单抗2002年，雷帕霉素2004年，依罗莫司,免疫抑制剂的发展,其它有发展前景的药物康乐霉素C布列奎钠（BQR）来氟米特和同类物（MNA）CTLA41g,药物监测的种类与方法,方法（常见）：荧光偏振免疫分析（FPIA）微粒子荧光免疫分析（MEIA）,1、竞争法原理,检测抗原.2、与荧光标记抗原竞争结合抗体.3、大小分子的不同旋转速度改变偏振光方向.4、偏振光的改变与被检测药物浓度有关.,微粒子荧光免疫分析法(MEI