合成生物学中的DNA合成、组装及应用.doc

合成生物学中DNA的合成、组装和应用摘要 近年来，以微芯片为基础的基因合成技术发生了令人振奋的新发展,基因合成技术具有显著增加产量和降低基因合成成本的潜力，连同更高效的酶促修复技术和基因组装技术，这些新技术正推动合成生物学走向更高水平。1.基因合成(不确定的地方全部原文标黄) 传统的寡核苷酸合成是用微升体积的溶液在小柱上进行合成。化学物和溶剂过柱后，逐步诱导核苷酸单体添加，形成增长的寡核苷酸链。依据标准的亚磷酰胺化学法，每轮反应包括以下四个步骤：1).脱保护；2).偶联；3). 封闭；4).氧化。过去几十年，商业上主要用固相亚磷酰胺化学法合成DNA。但由于化学反应效率上的局限，合成的寡核苷酸长度大部分不能超过150-200个碱基。如果超过这一长度，每步化学反应的副反应和低效率都会显著影响到序列的完整和产物的产率。 传统上，以DNA聚合酶或连接酶为基础的装配方式的基因构建以柱合成的寡核苷酸为（Traditionally, column-synthesized oligos are used as building blocks for gene construction using either DNA polymerase based or DNA ligase based assembly methods.） 目前对基因装配技术有许多细节上的评价在文献里都能找到。能在一些综述里找到对当前基因装配技术更详细的评估。但是，由于柱基础的寡核苷酸合成花费高、生产量有限，这些都使大规模的基因合成和基因组装配在这个新的合成生物学时代遇到瓶颈。 微阵列芯片作为一个不昂贵的寡核苷酸高密度阵列近年来引起了广泛的关注。在微阵列芯片上进行合成允许小型化和平行方式产生大量的独特寡核苷酸序列（Synthesis on microarrays allow large numbers of unique oligo sequences to be generated in a miniaturized and parallel fashion），而且在产量、试剂消耗、花费上都有很大优势。与早期的微阵列合成寡核苷酸池进行基因装配相比，后来的微阵列在质量、效率、寡核苷酸合成与基因组装自动化上都有了令人激动的发展。图1总结出了进步之处。 用微阵列技术进行基因合成也有一定的挑战性。最大的挑战就是微阵列产生序列相对质量较差。在平面表面合成的寡核苷酸更容易出错，通常错误率大于柱合成的寡核苷酸。其中一个原因是脱保护剂/脱三苯甲基剂造成的迁延照射（即延长的暴露）使得“脱嘌呤”。通过优化试剂流动和反应条件，安捷伦科技的Leproust小组改进了反应过程，使高保真合成寡核苷酸池提高到200个碱基。另一个（错误率高的）原因是微阵列芯片合成中所谓的“边缘效应”。微阵列芯片合成大体上依靠于硅晶片上的直接且有空间性限制反应的具体机制。比如，安捷伦公司用喷墨印刷技术分配微微升溶剂到芯片上指定的位置。联川生物（LC Sciences）和美国昂飞公司（Affymetrix）在微流体系统中用激发光化学控制解封步骤（deblocking step）。CombiMatrix公司用可编程的微电极阵列在需要的点上进行氧化还原反应。这些例子里，序列的完整性会被没有对准的液滴、光束漂移或不合适的试剂隔离损坏，这就是所谓的“边缘效应”。但我们可以最小化这些“边缘效应”。在一个与喷墨芯片合成平面有关的研究中，一个有硅特性的塑料芯片可以降低“边缘效应”、有效减少合成寡核苷酸池的错误率，大约是200碱基或600碱基错1个（and could effectively reduce the error rate of synthetic oligonucleotide pools from approximately 1 in 200 bases to 1 in 600 bases）, 这个错误率就降到和柱合成差不多的水平了。 除了提高微阵列芯片的质量，近年来新一代测序技术（next-generation sequencing，NGS)作为产生已知序列的芯片造寡核苷酸（sequence-verified chip-made oligos）的预备工具从而进行基因装配（图1b 和图2）。微阵列芯片产生的寡核苷酸送入NGS工具，NGS工具能修正已知的和恢复后的序列（Microarray-derived oligos are fed into a NGS instrument where correct sequences were identified and retrieved）。这种技术预估使序列的精确性提高500倍再生产出来。（照这个趋势）未来的自动化技术可以大大减少人类操作步骤，一个运行就能测序并储存上百万的寡核苷酸，有构造百万碱基的DNA序列的潜力。虽然把这个技术转化为例行实作仍需要许多优化设计，但整合新一代测序和合成技术的概念是具有极大的吸引力和前景的。 利用微阵列芯片进行基因装配的另一个挑战是要提高芯片合成寡核苷酸池进行基因装配的效率和精确性。成千上万的寡核苷酸常产自于一个微阵列芯片。当对表面的数量如此巨大的寡核苷酸进行放大和收集时，正是因为寡核苷酸池的复杂的异源性使随后的基因装配效率低、具有挑战性。近期科学家开发了一些策略来解决这些问题。其中一个方法是，应用寡核苷酸杂交选择原则（oligo hybridization-selection principles），Borovkov等优化了寡核苷酸设计和基因装配条件从而在并入的装配中排除了错误的寡核苷酸。开发基于模块的方法可以剔除需要昂贵的、劳动密集的纯化过程的寡核苷酸，还能放大基因装配的准备步骤。运用这些方法，基因可以在由微阵列芯片产生的、未纯化的、含有少于5%完美序列的寡核苷酸池中直接装配。 另一个提高基因装配效率的方法是选择性应用芯片上寡核苷酸的子存储池（subpools）Kosuri 等用这个策略设计了25万的短引物，考虑到为了后续组装的选出片段的特异放大（图1c和图3）。由于高GC含量和重复序列，以前难合成的40个单链抗体基因的无错基因组装现在都可以演示出来。 为了高效基因装配，降低寡核苷酸池的大小，第三种方法是物理划分微阵列芯片为一个个子阵（sub-arrays）。我们团队用一个表面压印高达30个微孔的塑料芯片来测试这个技术（图1d和图4）。每个孔合成一个子阵并组装成单个基因构造。 微阵列芯片产生的寡核苷酸池提供了一个便宜的寡核苷酸来源，但并不能简化下游基因装配过程、降低其成本。在许多案例中，大的复杂的寡核苷酸池使基因装配更有挑战性且更易错。为了阐明这个问题，我们对同样芯片的每个孔的阵列寡核苷酸合成、放大和基因装配步骤进行了整合。首先，我们用等温切口和链置换扩增（strand-displacement amplification）反应代替化学法从芯片上脱离出为了进行基因装配的寡核苷酸来放大和释放重叠基因构造的寡核苷酸进入密封孔。然后，不需要转换缓冲液或手动操作，聚合酶循环装配反应就会发生在同样的微池中构造基因序列，每个现能达到1kb（图4）。完整的过程在片上试验（on-chip）完成来增加产量并最小化运转时间和谬误杂交。这个平台可与下游反应连接达到小型化、自动化的高通量合成。2.长链DNA合成 构建长度超过单一基因的长链DNA，仍然面临其他的挑战。除了传统的限制性内切酶消化和连接方法以外，还可以通过BioBrick19、BglBrick20这两种方法对基因片段进行拼接，在这些方法中各基因片段通过含有限制性酶切位点的标准化侧翼序列顺序连接成更长的基因片段。虽然科研工作者一直尝试对这个方法进行改进以实现这个过程的标准化和自动化，但是无法实现无痕组装限制了BioBrick和BglBrick，使其不能成为常用长序列合成途径。更重要的是，由于“inhibitory sequences抑制序列”的存在常常使限制酶无法切割这些长链DNA。使用II型限制性内切酶切断“inhibitory sequences抑制序列”周围的识别序列，有效地缓解了这一问题23-26，但由于这个方法一系列的特性，应用起来依然非常困难。 限制性酶切-连接拼接法的替代方法主要包括几种重叠延伸PCR 技术(Overlapping extension PCR，OE-PCR)，能够实现不依赖序列的无痕组装。在这类PCR反应中，同源末端将邻近的DNA分子连接在一起，并于下一个循环引发扩增。环形聚合酶延伸法(Circularpolymerase extension ，CPEC) 是一种简便的DNA片段组装方法，已成功用于高通量平行组装和组合库的构建。除此之外，还有In-Fusion (Clontech的商品化试剂盒)29，尿嘧啶特异性切除试剂(Uracil-specific excision reagent，USER) 30及不依赖序列和连接反应的克隆法(Sequence-independent and ligationindependent cloning，SLIC)31。但是，这些方法更适用于质粒或小途径的构建，因为随着产物长度的增加，PCR 反应效率下降，错误率升高。而Gibson 等温组装法(Gibson isothermal assembly)却是个例外，该法可以组装长达几百kb 的基因组水平的片段32。应用类似的方法，直接利用柱合成的60-mer 寡核苷酸成功构建出长达16.3 kb的线粒体基因组33。 不过，虽然上述体外基因组装方法取得了很大的进步，但似乎已达到了体外方法所能组装的DNA 序列长度的极限。对于更长的片段，采用酿酒酵母体内同源重组法进行拼接则更为有效，由于酿酒酵母对长片段的兼容性好且其DNA修复机制复杂、准确性高，该方法已被成功用于0.5-1 Mb 细菌基因组的合成、重叠寡核苷酸的直接组装及各种遗传途径的构建34-36。3. 错配修复技术Error correction 尽管已采取多种方法尽可能除去寡核苷酸合成产物中的错误，包括化学合成方法的优化9，严格的杂交选择10,16及全面彻底的纯化，但是微量的错误依然会被带入到组装过程中，在下游基因片段中被累积。针对这个问题，目前主要根据错配结合或错配裂解原理，利用相关酶来减少这一阶段的合成错误，最近的一篇综述文章对基因合成中错配修复技术进行了详细地介绍37。值得注意的是，最近发表的两项大规模芯片合成研究都采用了基于CEL的错配特异性内切酶作为可靠的质量控制方法来显著地降低错误率17-18。在这两个基因错误修复反应中，错配位点处被裂解并消除，余下的无错片段被重新组装成完整的基因。据报道，经过两轮修复，合成基因的错误率可降低16倍以上，为1/8 701 bp38。4.在合成生物学中的应用 合成DNA应用广泛，从基因电路、代谢途径到合成基因组都有应用。由于构造、操作和分析DNA的能力的提高，这使得人们可以去设计、操作DNA，甚至创造人工生命系统。美国克雷格.文特尔研究所的科学家们从头合成并组装了含有一百万碱基对细菌基因组。当将这个基因组放置在一个缺乏自己遗传物质的细菌宿主细胞中，它能够成功地产生人工活细胞。这一成就是合成生物学的一个新里程碑，并且为合成生物学的进一步发展提供了潜在的研究框架。 获取基因组启动软件仅仅是生物工程过程的开始。任何基因组的设计和工程尚处于起步阶段。在基因组结构中即使存在适度的错误，也可能导致遗传系统失去功能。虽然，不久后合成DNA的能力不再是合成生物学的真正限制因素，但是还不能对复杂的生物过程有一个全面深入的了解，因此，从这个意义上来说，研究者们在准备设计基因组之前，还应对基因组的合成进行深入研究。 合成生物学的一个重要领域是代谢工程。通过有目的改造现有的生物体，通过构建平行的代谢系统，与天然细胞代谢机器相互协同工作，研究者可以根据实际应用设计细胞，如合成高值化学品或药物等。Keasling 等在酵母中构建了青蒿素合成途径，使这种药物的微生物生产成本降为从稀有青蒿植物中提取的1/10。 芯片基因合成方法保真度的提高使研究人员可以直接利用芯片合成的寡核苷酸库。王等人开发了一种被称为多重自动基因组改造（MAGE）的高通量基因组原型系统，他们通过允许细菌接收“编辑”DNA链文库，这种DNA链被设计成可以同时在多个基因位点进行操作，从而获得5倍高表达的目标蛋白。最近的研究利用MAGE技术，用同义的TAA密码子来位点特异性地替换32种大肠杆菌菌株中的TAG终止密码子。MAGE和分级结合组装基因组改造（CAGE）技术联用可对基因组上的多个位点乃至整个基因组进行密码子优化，让编辑和进化同时进行成为了可能。 另一项有趣的研究利用了DNA微阵列合成的复杂性和差异性。泉等人根据他们的合成基因芯片，利用密码子来优化蛋白表达。合成基因芯片就是一个能够编码相同基因的同义密码子突变体库。高度表达的密码子变异体可以通过表达筛选被识别。这些构建的文库被用于优化74个果蝇转录因子的表达，这样可以体现这种技术的稳健性。 在全基因组合成领域，基因合成技术最直接的应用目标是病毒基因组。病毒基因组较小，是疫苗研发的良好工程靶向。在代谢工程等领域进行密码子优化，通常是为了在异源宿主中得到更高的蛋白表达量，而疫苗研发则正好相反，需要通过全局密码子去优化来生产减毒的病毒。Coleman 等开发了合成减毒病毒（SAVE)，即打乱病毒基因组固有的密码子偏好，利用计算机对病毒基因组进行大规模重新设计。最近经SAVE 设计的减毒流感病毒已成功获得了有效疫苗。随着基因合成技术的迅速发展，病毒全基因组的重新设计和合成必将带来巨大的经济效益。结语 在过去的40 年里，DNA 从头化学合成和基因组装技术发展迅速，合成与组装能力已从不足100 bp 提高到1Mp 以上，在代谢工程、遗传网络设计和基因组合成方面