基因工程原理-复习资料

0、基因工程的技术基础和理论基础1）理论基础：40年代确定遗传信息携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，明确了物质基础50年代确定DNA的双螺旋模型和半保留复制机理，明确自我复制和传递60年代提出中心法则和操纵子学说，破译遗传密码，阐明信息流向和表达。2）技术基础：60年代的琼脂糖凝胶和Southern转移杂交技术，用于DNA分离和检测60年代初70年代末，发现限制性内切酶和DNA连接酶，实现体外切割70年代中期，实现DNA分子的核苷酸序列分析技术80年代实现体外重组DNA并进入宿主细胞1、基因工程研究的主要内容或步骤 从生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段； 在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制载体分子上，形成重组DNA分子； 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖； 从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆； 从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用； 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要物质。2、三位一体的基因概念 基因既是携带生物体遗传信息的结构单位，又是控制一个特定性状的功能单位。 基因是染色体上的实体 基因象链珠(bead)一样，孤立地呈线状地排列在染色体上基因是功能、突变、交换“三位一体”的最小的、不可分割的、基本的遗传单位。3、一位一体的基因概念基因是一个具有特定功能的、完整的、不可分割的最小的遗传单位。基因内可以较低频率发生基因内的重组和交换。4、顺反子假说1个顺反子决定1条多肽链。能产生1条多肽链的是1个顺反子，Cistron是基因的同义词。在一个顺反子内，有若干个突变单位：突变子(muton)。在一个顺反子内，有若干个交换单位：交换子（recon）。5、全同等位基因在同一基因座位(locus)中，同一突变位点（site）向不同方向发生突变所形成的等位基因(homoallele)。6、非全同等位基因在同一基因座位（locus）中，不同突变位点（site）发生突变所形成的等位基因(heteroallele)。7、重叠基因的概念及其生物学意义概念：大多数由一条DNA序列组成的基因，仅有编码一种蛋白质的功能(尽管基因在两端有非编码区，并且在编码区内有内含子)。但是，有些情况下，一条序列编码不止一种蛋白质。生物学意义：a)原核生物进化的经济原则(较小的C值编码较多的基因信息)；b)提高蛋白质的疏水性,以增强生物体自然选择的适应性。8、重复基因的概念及其生物学意义概念：在染色体组上存在多份拷贝的基因。重复基因往往是生命活动中最基本、最重要的功能相关的基因。生物学意义：a)含有遗传调控信息:一些基因呈高度重复排列，如核糖体基因。这些基因的重复排列方式可以快速、大量地表达出蛋白产物，从而满足机体的需要；调控基因复制、转录、翻译。核酸碱基的错配更正，损伤修复，也受重复序列的影响。重复序列还可以形成核酸的高级构象，进而进行各种表观遗传修饰。b)促使核酸包装成各种高级结构:重复序列能够特异性地结合一些蛋白质，从而使核酸序列形成二级、三级甚至更高级结构。c)通过染色体的异染色质化而关闭基因的表达d)维持重要基因的正常结构，保证生命活动的正常进行：大量的重复序列保持重要的编码基因相对稳定，这才能维持正常的生命活动；e)为遗传变异和新基因的生成提供了空间，产生进化的动力：新变异或者新基因经常出现在容易发生突变与重组的重复区域，既不会破坏原来的遗传信息，又可以提供突变进行的场所，产生新性状。9、断裂基因的概念及其生物学意义概念：真核生物的结构基因是由若干exon和intron相间隔排列的序列组成的间隔基因（断裂基因）。a)Intron并非“含而不露”；b)Exon并非“表里如一”；c)并非真核生物所有的结构基因均为splittinggene。生物学意义：a) 有利于遗传的相对稳定:即使错误剪接留下的intron部分,被mRNA监测系统降解,避免病变和死亡；b) 增加变异机率，有利于生物的进化：内含子增加了基因的长度，增加了基因内的重组交换几率，有利于形成变异和生物多样性；c) 扩大生物体的遗传信息储量：对Exon和intron不同方式的剪接（选择性剪接），形成不同的基因产物；d) 通过改变读码框架，利用intron编码基因。10、跳跃基因的概念及其生物学意义概念：跳跃基因也叫做转座子，是一些能够从一个染色体位置转移到另外的位置的DNA序列。跳跃基因在生物体中广泛存在。生物学意义：转座子对基因而言是一个不稳定因素，他可导致宿主序列删除、倒位或易位，并且在基因组中成为可移动的同源区。产生新的变异，有利于进化。目前转座子元件是植物分子生物学操作和植物基因工程中分离克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大类反转录转座子具有分布广、异源转座高和受组织培养诱导激活等优势，因此它的发现和利用又为转座子标签的应用提供了更广阔的前景。此外通过对现有转座元件的改造以及转座元件作为载体改造的工具，也将大大加速植物基因和功能序列的分离与研究，如利用转座子元件构建启动子捕捉载体，效率比T-DNA标签高11、假基因在演化过程中，很多基因经过了复制，其中的一个版本积累了使其失去功能的突变。 与正常基因结构相似但丧失正常功能的DNA序列； 假基因都是在真核生物的基因组中发现的，在原核生物中未见报道; 假基因由活化的原始基因突变而来，这是因为存在着在某个阶段伤及基因表达的一种或多种缺陷（如启动子错误、有缺陷的剪接信号、框架中有终止信号等）之故; 大多数基因家族都有一些成员是假基因。12、模糊基因RNA编辑造成了mRNA的密码子的大部分，使它们从无意义信使成为有意义的信使,它们原来的基因的A序列只不过是一串简略的意义模糊的序列(abreviateorcrypticgene)，这一串简略的意义模糊的序列称为隐秘基因或模糊基因(cryptogene)。模糊基因在病毒、原生动物、哺乳动物与植物中广泛存在。13、表观遗传修饰的方式DNA分子的特定碱基的结构修饰(如胞嘧啶的甲基化)；染色质构型重塑(chromatinremodeling)(如组蛋白的构型变化)：组成核小体的组蛋白可以被多种化学加合物所修饰，如磷酸化、乙酰化和甲基化等，组蛋白的这类结构修饰可使染色质的构型发生改变，称为染色质构型重塑。a)组蛋白不同氨基酸残基的乙酰化一般与活化的染色质构型常染色质和有表达活性的基因相关联；b)组蛋白甲基化可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的赖氨酸处于什么位置；基因组印记:生物体中约有1%的基因并不按照孟德尔规律遗传，而是只表达来源于双亲中的某一单亲的基因,这种现象称为基因组印迹，那个被掩盖了的基因叫做被印迹的基因。DNA甲基化是“imprint”的重要机制；PTGS(RNAi)。14、从基因概念的发展说明C值矛盾形成的原因一个物种的单倍体的染色体的数目称为该物种的基因组。单倍体基因组总DNA的含量的称为最大C值；编码基因信息的总DNA含量称为最小C值。C值悖论: 生物体进化程度高低与大C值不成明显正相关。一些植物和两栖类动物，它们的DNA含量高达10101011bp，而人类DNA含量仅为109bp； 亲缘关系相近的生物大C值相差较大； 一种生物内大C值与小C值相差极大。原因：真核生物基因组中存在大量的不编码基因产物的DNA序列，一般而言，越是简单的生物基因组不编码蛋白质的DNA序列越少，它们的结构基因的数目越接近DNA含量所估计的基因数。15、限制修饰系统限制修饰系统（Restrictionmodificationsystem或R-M系统）是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。16、限制性内切酶的命名原则宿主：属名第一字母、种名头两个字母；菌株或型号；序号：罗马字。例如Hind限制性内切酶：Hin指来源于流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)，d表示来自菌株Rd，表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加R或M，且菌株号和序号小写；现在限制性内切酶名称中的R省略不写；Escherichiacoli。17、限制与修饰系统的种类根据酶的亚单位组成,识别序列的种类,是否需要辅助因子，分三类(I,II,III)也有分四类，IIs类，即II亚类。18、限制性内切酶识别的序列的特点1）识别序列长度：一般4-8，最常见为6；当识别序列为4个和6个碱基时，在可识别序列完全随机的情况下，平均256和4096个碱基出现一个识别位点。2）识别序列的结构：多数为回文对称：切割位点在DNA两条链相对称的位置；少数限制酶的识别序列非对称；多识别序列(简并序列):可识别多种序列；间断对称:有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。3）切割位置:大多数内部；一部分在两端；还有一部分在两侧。19、限制性内切酶产生的末端类型1）匹配粘端(粘性末端）:识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesiveend），这样形成的两个末端相同，也是互补的；2）平端(Bluntend):在回文对称轴上同时切割DNA的两条链；3）非对称突出端:来自非对称识别序列，切割的DNA末端是不同的；简并序列；间隔序列：间隔区域序列是任意的；4）同裂酶(isoschizomer):识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。同序同切，识别位点和切割位置相同；同序异切：识别位点相同，但切割位点不同；“同功多位”：识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。5）同尾酶:许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同且对称，既可以产生相同的粘性末端。同尾酶切割DNA产生的末端可以进行互补连接。20、位点偏爱产生的原因某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。原因：(1)Nar，Nae和Sac三种酶在切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用的一类酶；(2)BspMI、EcoRII、HpaII它们对要求作用的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是激活另一个的变构位点(allosteric)。由顺式方式提供（cis）：它们相互靠近或可形成环（loop），或由反式作用提供：其变构位点由含识别序列的寡核苷酸提供；BspMI难以切割DNA：在pBR322和pUC18/19中有一个BspMI位点，100倍的过量切割时/一半DNA未切割。21、星星活性产生的原因在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。限制酶的特异性变化方式与酶的种类和所应用的条件有关。最普遍的活性变化是1个碱基的变化；识别位点外层碱基的随意性以及单链缺口引起星星活性的因素:高浓度甘油（5%）；酶过量（100U/g）；低离子强度（pH8.0)；有机溶剂（如DMSO，乙醇，乙二醇等）；用其它二价阳离子（Mn+，Cu+，Co+,Zn+）代替Mg+。抑制星星活性的条件（措施）减少酶的用量，避免过量酶切,减少甘油浓度；保证反应体系中无有机溶济或乙醇；提高离子强度到100150mM(如果不会抑制的话)； 降低反应pH至pH7.0；使用Mg+作为二价阳离子。22、酶切反应条件（缓冲液、双酶切策略、反应温度等）1）缓冲液：常规缓冲液：pH：通常7.0-7.9(at25)，用Tris-HCl或乙酸调节；Mg+：作为酶的活性中心，由10mMMgCl2或MgAc调节，一般为10mmol/L；DTT(二硫苏糖醇)1mM：有抗氧化作用（强于巯基乙醇），保护酶分子上的还原性基团，稳定酶的活性；BSA（bovineserumalbumin）（100mg/ml）：少数需要（BSA是酶的稳定剂，防止酶分解和非特异性吸附；BSA能减轻有些酶的变性，能减轻有些环境因素如加热,表面张力及化学因素引起的变性；BSA能防止酶吸附到管壁而损失）。离子强度：不同酶对离子强度的要求差异大，一般用NaCl来调节。通用缓冲体系:one-Phor-Allbufferplus,OPA+(通用缓冲液):可以适用所有的限制酶，缓冲液包括100mmol/LTris-HCl,500mmol/L乙酸镁和100mmol/L乙酸钾；不同酶使用的最佳浓度不同；常用浓度有0.5X，1X，1.5X，2X等。双酶切策略:a）选用都合适的Buffer或通用缓冲液；b)若找不到共用的缓冲液，可先用低浓度的，再加适量NaCl和第二种酶；c)或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液。2)反应温度:大多数为37，一部分为50-65，少数25-30；高温作用酶在37时活性会下降，一般为最适条件的10-50%；一般销售产品说明中都会表明最佳温度。3）反应时间:1hrormore，许多酶延长其反应时间可减少酶的用量。4）反应终止:EDTA（通过螯合镁离子），终10mM；加热:37酶65或80处理；80处理20min仍失活的酶，可以用苯酚去除蛋白。23、酶切位点的引入方法1）产生的5突出端补平后连接:将产生的5突出端补平后，再连接可产生新的酶切位点。2）同尾末端的连接:不同的同尾酶切割DNA产生的末端在相互连接时，可以产生新的酶切位点，同时原先的酶切位点消失。3）平端连接。24、甲基化酶概念和类型原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。在E.coli中，大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶。在真核和原核生物中存在大量甲基化酶。1）Dam甲基化酶：GATC腺嘌呤N6位置引入甲基；有些限制酶对Dam甲基化敏感，不能切割相应的序列，如BclI,ClaI,MboI,XbaI等；不敏感的有BamHI,Sau3AI,BglII,PvuI等。一般哺乳动物DNA不会在A-N6上甲基化；当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从dam-E.coli中提取DNA。2）Dcm甲基化酶：识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个C上C5位置上引入甲基。3）EcoKI甲基化酶：识别AAC(N)6GTGC；TTG(N)6CACG序列中AN6位置；但识别位点少(1/8kb)研究较少。4）SssI甲基化酶：来自原核生物Spiroplasma，CG序列中的C在C5位置上甲基化，可在未甲基化或半甲基化链上起作用。许多酶对此甲基化敏感。25、甲基化对限制酶切的影响1）修饰酶切位点：HincII：GTCGAC，GTCAAC，GTTGAC，GTTAAC；BamHIGGATCC；M.MspI：m5CCGG；如果BamHI前面为CC或后面为GG，那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割。构建DNA文库时用AluI(AGCT)和HaeIII(GGCC)部分消化基因组DNA；用M.EcoRI甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头，当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割。2）产生新酶切位点；3）用于研究细胞DNA中位点特异性甲基化的水平及分布；4）对基因组作图的影响:在哺乳动物DNA中：CpG序列出现的频率大约只有预计的1/5；含CpG序列的识别序列极其稀少；大多数CpG都发生甲基化；含CpG的所有识别序列的酶不能切割。26、常见DNA聚合酶类型及特点真核细胞有4种DNApoly：位于细胞核内，催化细胞增生；：小分子蛋白质（4.4kDa）曾从小牛胸腺中提取，与细胞增生无关；：100kDa，利用RNA为模板的效率比利用DNA为模板的效率高；其它：线粒体DNA聚合酶、催化线粒体DNA合成。原核细胞三种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关I单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长II与低分子脱氧核苷酸链的延长有关III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶1）大肠杆菌DNA聚合酶I(EcoliDNApolymeraseI)：活性：单链多肽(109kDa)，有三种活性。a)53DNA聚合酶活性。底物:模板(ssDNA),引物（带3OH基）或5突出DsDNA；b)53外切核酸酶活性。底物:dsDNAorDNA:RNA杂交体；从5端降解dsDNA，也降解RNA:DNA中的RNA(RNaseH活性)；c)35外切酶活性(proofreading):底物：3-OHdsDNAorssDNA;从3-OH端降解DNA，可被53聚合活性封闭。用途：a)切口平移法标记DNA：（所有DNApoly中只有此有此活性）产生切口，外切活性和合成活性共同作用使切口沿5-3方向平移；若有放射性dNTP,则可标记成探针。b)用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性，但由于有5-3外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶。c)末端标记（交换或置换反应）：T4DNApoly、T7DNApoly更好。2）Klenow酶：Klenowfragment：将大肠杆菌DNApolyI在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解,从全酶中除去53外切活性片段，而聚合活性和35外切活性不受影响。活性，共两种,同DNApolyI。作用：a)补平3凹端，注意要用dNTP，如果使用带标记的dNTP，可对末端进行标记；b)抹平3凸端，注意必须加足量dNTP；T4和T7具更强3-5外切活性，被取代c)末端标记：A置换反应同前,同样被T4poly代替；B补平3-凹端的过程进行标记。d)cDNA克隆中合成第二链e)随机引物标记f)DNA测序（Sanger双脱氧链末端终止法）被T7取代，Taq等PCR酶。g)PCR反应被Taq等取代h)在体外诱变中，用于从单链模板合成dsDNA3)T4噬菌体DNA聚合酶:活性与Klenow酶相似，但35外切活性强200倍；用途：a)补平或标记3凹端，必须有高浓度dNTP（末端标记）b)置换反应:必须有高浓度dNTP(一种)末端标记c)标记DNA片段：即利用外切活性产生了3凹端，再补平（用标记的dNTP）4)T7噬菌体DNA聚合酶:来源于T7phage感染的E.coli，为两种紧密结合的蛋白质复合体(基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白)活性：T7DNApoly为持续合成能力最强的一个，平均长度要大得多,在测序时具有优势；活性/功能与T4DNApoly、Klenow类似，但35外切活性是Klenow的1000倍用途:a)替代T4的功能b)长模板的引物延伸c)修饰的T7DNApolymerase用于测序反应（测序酶）SequenaseUSBBiochemical.99%35外切活性被除去.5)耐热DNA聚合酶6)反转录酶Reversetranscriptase:依赖于RNA的DNA聚合酶,具有53合成DNA活性；无35外切酶活性。种类a)来自AMV（禽成髓细胞瘤病毒）。二链多肽(62kDa/94kDa)；具53DNA聚合活性；具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA)；在反应开始时，引物和mRNA模板杂交体可成为RNaseH的底物,此时模板的降解和cDNA的合成相竞争；终止时，RNaseH可在正在增长的DNA链近3端切割模板，趋向于抑制cDNA的产量并限制其长度；b)Mo-MLV(M-MuLV)：Moloney鼠白血病病毒。单肽84kDaRNaseH活性弱，利于合成较长cDNA；纯度高、工程产品，42失活。用途a)cDNA克隆中第一链的合成b)测转录起始点（引物延伸法）c)5突出DNA的补平d)测序反应(当用DNApolyI,Klenow或测序酶不理想时)e)其它RT-PCRRNA二级结构活性a)53DNA聚合活性（Mg+）:RNAorDNA模板及带3OH的RNA或DNA引物b)RNaseH活性注意事项a)无35外切校正作用，在高dNTP和Mn2+时，每500个bases会有一个误掺入。b)为防止新合成的DNA提前终止，需高浓度dNTP。c)单链拷贝，也可双链合成（自身序列为引物，但效率低）,50mg/ml放线菌毒D，抑制第二链合成。7)末端转移酶:来源于小牛胸腺,存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNApoly,是不依赖模板的DNA聚合酶;在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3羟基端。底物DNA,可短至3个核苷酸,对3突出的末端底物效率最高；低离子强度时,平端或3凹出端DNA亦可，但效率低；用途a)在3端加同聚尾，cDNA或载体，用于克隆，或标记b)末端标记ddNTP(标记的)27、Weiss单位和NEB单位Weiss单位：在37下20min催化1nmol32p从焦磷酸根置换到,-32PATP所需的酶量。NEB单位(NewEnglandBiolabs):通过粘性末端的连接效率来表示。即，在20l反应体系中于16，使Hind切过的DNA（300g/ml，0.12M5末端）在30分钟内连接50%所需的酶量为1个NEB单位。1Weiss=67粘端连接单位(NEB单位)。1NEB单位=0.015Weiss单位。28、载体由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的DNA片段连接在它的上面，而进行复制。29、作为基因克隆载体的条件1）容量：分子较小，可携带比较大的DNA片段；2）（复制：能独立于染色体而进行自主高效的复制；3）酶切位点：有尽可能多的多种限制酶切位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）；4）标记：有适合的标记，易于选择；5）安全性：要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。6）表达：有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达；30、质粒载体必须具备的基本条件并列举2-3种质粒载体特点质粒载体必须具备的基本条件1）具有复制起点：自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。2）具有抗菌素抗性：理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。3）具有若干限制酶切单一位点多克隆位点（multiplecloningsite，MCS）；4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。低分子量的质粒易于操作，克隆外源片段后仍能有效的转化给受体细胞，同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低。pSC101质粒载体:严谨型复制控制的低拷贝数大肠杆菌质粒载体，每个寄主细胞有12个拷贝；分子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr）；有Hind、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、Sma7种核酸内切限制酶。其中在Hind、BamH、Sma3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr基因失活；是第一个真核生物的克隆载体。pBR322质粒载体：具有较小的分子量：4363bp，克隆载体的分子量大小不要超过10kb；具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号；有24种核酸内切酶的单一酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点。31、pUC质粒载体的特点和优点应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，加入了一个在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因。1）典型pUC系列质粒载体特征：来自pBR322质粒的复制起点；氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点。大肠杆菌-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码-肽链的DNA序列；位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段。2）pUC质粒载体的优点：具有较小的分子量和更高的拷贝数：仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500700个拷贝。适用于组织化学检测重组体：具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定。具有多克隆位点MCS区段：方便具有不同粘性末端的外源片段的插入。32、穿梭质粒载体的概念人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体；大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体；大肠杆菌-牛乳头瘤病毒。33、噬菌体载体的主要类型和特点1）插入式载体:只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体；通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体。由于噬菌体对所包装的DNA有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6kb外源DNA片段，最大11kb。cI基因插入失活：如gt10，基因cI内有一个EcoR位点。其他EcoR位点都去除掉了，基因cI内的EcoR位点作为唯一位点，可用于外源DNA片段的插入。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶源化，产生清晰噬菌斑。LacZ基因插入失活：如lgt11载体该载体最大特点是在最左侧可替代区置换了一段lacZ基因，可编码b-半乳糖苷酶，在IPTG/X-gal平板上形成兰色噬菌斑。lacZ基因编码区终止密码子之前有一个EcoRI位点，可用于外源DNA片段的插入。筛选时，在lac-宿主菌中非重组噬菌斑为兰色。当外源DNA片段与lacZ的阅读框相吻合时，可表达出融合蛋白，可用免疫学方法筛选阳性重组子。2）替换型载体（取代型载体）：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。通过特定酶切位点允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载体，称为置换型载体。如：EMBL3和EMBL4EMBL3和EMBL4载体为43kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为20kb、9kb和14kb。克隆DNA片段大小为9-23kb，在填充片段两端带有对称的多克隆位点，这两个载体的差别是多克隆位点的排列位置相反。3）凯伦噬菌体载体：既有插入型，又有替换型，在基因工程实验中的用途十分广泛;承受外源DNA的能力：几个kb到23kb。34、单链DNA噬菌体载体类型和特点单链DNA噬菌体的复制，以双链环形的DNA为媒介，这种复制形式的DNA（replicativeformDNA）简称RFDNA；不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的大小制约的，不存在包装限制问题；容易测定外源DNA片段的插入取向；M13：一种含单链（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，基因组大小为6.4kb；成熟噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，其感染位点在性纤毛上；噬菌体颗粒大小受其DNA大小制约，这一点正好与噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。M13噬菌体基因组可编码3类蛋白质复制蛋白（基因，和）；形态发生蛋白（基因，和）；结构蛋白（基因、和），所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中；基因组DNA为正链，按基因至基因方向合成，与噬菌体的mRNA序列同义。单链DNA的酶切和连接比较困难，因此M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RFDNA。RFDNA容易从感染细胞中纯化出来，可象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。35、常用噬菌粒载体pUC118和pUC119的特点常用噬菌粒载体pUC118和pUC1191）具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，易于进行分离与操作；2）ampr基因作为选择记号，只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子才能在含有氨苄青霉素的培养基中生长；3）拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；4）存在着一个多克隆位点区，不同类型的外源DNA片段不经修饰便可直接插入到载体分子上；5）由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；6）含有质粒复制起点，在无辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规方式，复制形成大量的双链DNA分子；7）带有M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可合成单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中；8）pUC118和pUC119：多克隆位点区的核苷酸序列取向彼此相反，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA。36、柯斯质粒载体特点以及粘粒载体的工作原理cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。用于克隆大片段DNA的载体，由噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等。该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。柯斯质粒载体的特点：具有噬菌体的特性；具有质粒载体的特性；具有较高容量的克隆能力；具有与同源性序列质粒进行重组的能力。粘粒载体的工作原理类似噬菌体载体，在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于噬菌体载体的左右臂，cos位点通过粘端退火后与外源片段相间连接成多联体。多联体与噬菌体包装蛋白混合，噬菌体A基因蛋白的末端酶切割两个cos位点，并将两个同方向cos位点之间的片段包装到噬菌体颗粒中去。噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状重组DNA就象l 噬菌体DNA一样被注入细胞并通过cos位点环化，这样形成的环化分子含有完整的粘粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。带有重组粘粒的细菌可用含适当抗生素的培养基挑选。37、大肠杆菌表达载体组成和特点表达载体组成：大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。组成部分1）启动子强启动子、抑制型、诱导型与组成型强启动子：目的基因在启动子指导下转录出大量mRNA，使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上；抑制型启动子：启动子呈现出一种低的基础转录水平，在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件；诱导型启动子：能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如IPTG；PL、PR、lac、trp、tac；T7噬菌体启动子则属于组成型启动子2）转录终止子外源基因在强启动子控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物；终止信号存在于聚合酶已转录过的序列之中，这种提供终止信号的结构就称为终止子。终止子分为两类：一类不依赖于蛋白质辅因子就能实现终止作用；另一类则依赖蛋白辅因子（因子）才能实现终止作用。两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点前有一段回文序列。转录终止子能增强mRNA分子稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。3）转录起始序列5-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。在核糖体结合位点（RBS）的序列结构中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例，诱发碱基发生定点突变；或使用转译偶联系统进行克隆基因表达；4）转录增强子:显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。5）转译终止子mRNA转译终止必须存在终止密码子。大肠杆菌偏爱终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率将进一步的增强。38、T7噬菌体启动子的表达载体作用机制T7噬菌体启动子PET系列表达载体是目前使用最广泛的表达载体；表达能力强；可控性好。其组成是在载体的基本结构的基础上加入T7噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点；当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。作用机制：T7启动子只能有T7噬菌体RNA聚合酶识别并启动转录，大肠杆菌RNA聚合酶不能作用T7启动子；宿主细胞必须能表达T7RNA聚合酶；大肠杆菌BL21（DE3）：大肠杆菌染色体BL21区整合有噬菌体DNA，在DE3区有T7RNA聚合酶基因，该基因受到lacUV5启动子控制；当PET载体进入BL21（DE3），宿主细胞的lacI基因产生阻遏物，抑制T7RNA聚合酶基因的表达，载体上的目标基因无法表达；IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，乳糖类似物）诱导后，和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录阻遏物失去作用，T7RNA聚合酶基因表达，产生T7RNA聚合酶，启动T7启动子控制的外源基因的表达。39、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位以及特点40、PCR扩增的技术原理以及PCR反应程序原理:PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法；优点：模板量少、无需纯化、快速特异、自动化。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链；成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；DNA模板-引物结合物在72、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。PCR反应体系:缓冲液、dNTP、引物、模板、DNA聚合酶。PCR反应程序1)常规程序将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94-96预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环2535次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72保持3-7min，使产物延伸完整，4保存。2)复性（退火）和延伸温度复性温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72；如果复性温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。3)反应时间变性步骤一般使用30秒钟；如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长，复性时间有30秒种一般是足够的；延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。4）循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104105数量级时，循环数通常为2535次；平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象；原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。5）PCR反应液的配制PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA聚合酶。早期PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发；对使用具3-5外切活性的高温DNA聚合酶时，有时会扩增不出产物；遇到这个问题时，若将反应成分分开配制，A管含模板、引物和dNTP及调整体积的H2O，B管含缓冲液、DNA聚合酶，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题；按照常规方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决这一问题。将dNTP、缓冲液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蜡珠（如AmpliWaxPCRQam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有当PCR反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。41、长片段的PCR扩增方法常规PCR反应产物一般在2kb以下。在PCR反应中，随着扩增片段的延长，扩增效率随之降低。在长片段的PCR扩增过程中存在如下问题：高温会降低缓冲液缓冲能力，从而损害模板DNA和PCR产物；高温下其它二价离子的存在会促进DNA的裂解；长片段DNA分子的变性比短片段困难；DNA聚合酶与模板DNA的趋近和结合变得困难；错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发挥，从而限制产物的长度。提高扩增产物的长度采取措施：改进缓冲体系，适当升高镁离子浓度（10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500mmol/LTris-Cl(pH=9.0),160mmol/L硫酸铵，25mmol/LMgCl2,1.5mmol/LBSA）；采用混合DNA聚合酶，即主体使用扩增效率高、延伸能力强的TaqDNA聚合酶，少量使用具有3-5外切活性的高温DNA聚合酶（如Pfu或PwoDNA聚合酶），及时切除不匹配碱基的掺入，这样可使扩增长片段DNA有效实施；当需要扩增的片段大于20kb时，需加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)来提高PCR的效率，但甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度；Roche公司的长片段PCR扩增试剂盒将TaqDNA聚合酶和PwoDNA聚合酶接合起来，可扩增长达40kb的DNA片段。42、PCR扩增未知DNA片段方法1）反向PCR：当获得一段DNA后，若要得到与其相邻的未知DNA片段，可通过反向PCR来实现；反向PCR主要解决侧翼未知序列没有引物可用的问题；首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片段扩增出来。反向PCR技术主要用于克隆已知DNA片段周边的未知DNA片段以及从总RNA中克隆未知cDNA序列，研究病毒序列、转基因和转座子等的整合位点区域的序列。2）利用接头的PCR将基因组DNA用限制性酶切酶进行酶切，然后将序列已知的接头片段连接到酶切片段的两侧，以提供PCR需要的另一端引物；根据已知序列设计的引物和根据接头序列设计的引物，可以将已知序列侧翼的未知序列扩增出来。3）TAIL-PCR（thermalasymmetricinterlacedPCR）:交错式热不对称PCR，是一种染色体步移技术（GenomeWalking）；TAIL-PCR通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段；在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成：由特异性引物和简并引物扩增出的产物；由同一特异性引物扩增出的产物；由同一简并引物扩增出的产物。43、Southern杂交的基本流程和原理根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。步骤：(1)酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。(2)将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。(3)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4)让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。(5)通过显影检查目的DNA所在的位置。44、化学测序法和双脱氧法测序原理1）化学测序法：G系统：pH