诊断酶学(第五版)12.ppt

诊断酶学,临床生物化学检验,林孟戈,本章学习过程中请你思考:,1、酶学分析中工具酶参与的指示反应有哪些？2、血清酶活性浓度的测定技术有哪些？3、同工酶及其亚型的测定有哪些方法？4、临床常用血清酶测定有何临床意义？5、连续监测法测定酶活性浓度的原理和应用。,第一节概述,（一）酶的组成、结构和功能,酶的本质-绝大部分的酶是蛋白质，有些酶是核酸和酶蛋白组成的复合体，极少数酶的本质是核酸。酶的特性-极高的催化效率、高度的特异性(specificity)以及催化作用的可调节性,一、酶的概念与特征,酶的结构和功能,酶是蛋白质，具有一、二、三级结构，有些酶还具有四级结构。单体酶(monomericenzyme)-只由一条多肽链构成寡聚酶(oligomericenzyme)-由多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶多酶体系(multienzymesystem)-由几种不同功能的酶彼此聚合而成的多酶复合物酶的必需基团(essentialgroup)-与酶的活性密切相关的基团酶的活性中心(activecenter)-组成具有能与底物结合并起催化反应的特定空间结构区域,（二）酶的催化作用机制,酶主要通过与底物形成一种或多种中间复合物来降低反应的活化能。在酶促反应中，酶与底物结合时，底物首先和酶分子上的活性中心相结合，形成酶底物中间复合物（ES），降低反应的活化能，显著提高了反应速度。,（三）酶的命名、分类与编号,酶的命名-习惯命名法、系统命名法酶的分类-可分为六大类氧化还原酶(oxido-reductases)、转移酶(transferases)、水解酶(hydrolases)、裂解酶(或裂合酶)(lyases)、异构酶(isomerases)、合成酶(或连接酶)(synthetases或ligases)酶的编号-用4个数字加以系统编号第一个数字表示酶的类别，第二个表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个表示酶的编号序数。,酶的命名-习惯命名法、系统命名法,（四）酶分类与编号,习惯用名英文缩写EC编号系统名乳酸脱氢酶LD（LDH）1.1.1.27L乳酸：NAD+氧化还原酶单胺氧化酶MAO1.4.3.4单胺：氧化还原酶-谷氨酰转移酶-GT/GGT2.3.2.2-谷氨酰肽：氨基酸-谷氨酰转移酶门冬氨酸氨基转移酶AST2.6.1.1L-门冬氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶（谷草转氨酶）(GOT)丙氨酸氨基转移酶ALT2.6.1.2L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶（谷丙转氨酶）(GPT)肌酸激酶CK2.7.3.2三磷酸腺苷：肌酸转磷酸酶碱性磷酸酶ALP(AKP)3.1.3.1正磷酸单酯磷酸水解酶,临床酶学分析中常用酶的名称与编号,二、同工酶的概念与特征,同工酶是指催化相同化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。根据同工酶的来源和结构不同，从基因角度可将其分为单基因决定的同工酶、复等位基因同工酶、多基因决定的同工酶和修饰同工酶四类。,三、工具酶,通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。常用工具酶多为氧化还原酶类。,1偶联H2O2的工具酶及其指示反应,利用葡萄糖氧化酶等工具酶使相应底物被氧化生成H2O2。在POD的直接催化下，H2O2氧化芳香族胺色素原生成有色的色素,再进行比色测定。,2NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应,作为工具酶的脱氢酶如LD将底物的氢原子去除后传递给NAD(P)+而形成NAD(P)H。因NAD(P)H在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度法进行检测。,（一）工具酶参与的指示反应,（二）酶循环法,（405nm）,（三）代谢物浓度的酶法测定技术,直接法1终点法酶偶联法2动力学法,第二节酶测定技术,酶活性测定主要利用酶有加速化学反应（催化）的特性，通过测定被加速化学反应的反应速率，根据酶促反应中底物的减少量或产物的生成量来计算酶活性浓度的高低。,酶促反应动力学,酶促反应,酶促反应进程,一、酶活性测定,（一）定时法测定酶活性,终点法是在酶促反应平衡期（S或P不变）任何一点进行测定，故不需终止反应。,1直接法,是在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度等，从而计算出酶活性浓度。,2间接法,在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。,连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。,（二）连续监测法测定酶活性,酶偶联反应,ABCD,酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶,Ei指示酶,Ea辅助酶,Ex,Ei,Ea,工具酶,L-丙氨酸-酮戊二酸-丙酮酸L-谷氨酸,丙酮酸NADHH+乳酸NAD+,ALT（样品）,LD（试剂）,酶耦联法测定ALT,340nmA/min,-酮酸标本中,GLDH标本中,试剂1,试剂2,酶耦联法测定举例,(三)干扰因素,1其他酶和物质的干扰2酶的污染3非酶反应4分析容器的污染5沉淀形成,（四）血清酶活性浓度测定条件的优化(1)方法选择(2)仪器和设备(3)试剂(4)仪器参数的设置1方法类型2波长3样品量与试剂量4.稀释水量5反应时间6孵育时间7.延迟时间8.监测时间9.试剂吸光度上、下限10.底物耗尽限额11.线性度12.试剂空白速率13.线性范围14.计算因子F值(五)部分分析前因素对酶活性测定的干扰1溶血2抗凝剂3标本储存温度,（六）酶活性浓度的单位1.酶活性单位（1）惯用单位（2）国际单位-在特定的条件下，一分钟内使底物转变一微摩尔的酶量为一个国际单位。（3）Katal单位-在规定条件下，每秒钟催化转化一摩尔底物的酶量。1katal60106U,2.酶活性浓度单位以每单位体积所含的酶活性单位数表示。（1）表示方法-UL（2）酶活性浓度单位的计算-用连续监测法测定时，根据摩尔消光系数计算。,3.参考值和正常上限倍数的应用（1）参考区间（2）正常上限倍数的应用正常上限(upperlimitsofnormal，ULN)倍数作为酶活性浓度的表示法，就是测定值除以正常上限值。,（七）系数K值的计算与应用,1.系数K值的意义与设置2.系数K值的类型与计算,（八）临床酶学测定的标准化,1.标准化途径1使用推荐方法和参考方法2使用公认的酶校正物或酶参考物2.酶活性浓度测定的参考系统1建立原级参考方法2制备原级参考物3建立参考实验室网络,（一）测定原理（二）免疫化学测定的优缺点优点主要有：灵敏度高特异性高能用于一些不表现酶活性的酶蛋白特别适用于同工酶的测定局限性主要有：制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清较困难测定步骤多，操作繁琐测定成本高,二、酶质量测定,三、同工酶检测,(一)电泳法-琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。(二)层析法,血清LD电泳图谱分析,正常和病理状况时血清CK同工酶谱,(三)免疫分析法免疫抑制法利用同工酶的一种亚基与相应的抗体结合后，酶活性受到抑制，测定加与不加抗体前后样品中酶活性的变化，可以计算出该型同工酶的活性。不加抗CK-MM血清时样品的CK活性：CK-MM和CK-MB活性；加入抗CK-MM血清时样品的CK活性：50CK-MB的活性；加入抗CK-MM血清时样品的CK活性2：CK-MB活性；所测CK-MM和CK-MB之总活性CK-MB活性CK-MM活性。,(四)动力学分析法1底物特异性分析法2抑制剂分析法3pH分析法4热失活分析法(五)蛋白酶水解法,第三节常用酶及同工酶测定的临床应用,一、血清酶,血清酶活性升高的原因：组织器官受损造成细胞破坏或细胞膜通透性增高，细胞内的某些酶大量释放入血；细胞的转换率增高或细胞的增殖加快，其特异的标志酶释放入血；细胞内酶的合成或诱导增强；酶的清除受阻。,1、血清酶的来源（1）血浆特异酶（2）非血浆特异酶外分泌酶细胞酶2、血清酶的去路（1）血清酶的半寿期（2）血清酶的失活和排泄,（一）血清酶的来源与去路,（二）血清酶的生理差异1性别2年龄3进食4运动5妊娠6其他,常用的酶谱：(1)心肌酶谱-AST、LD、CK、CK-MB、CK-MB亚型或CK-MM亚型(2)肌酶谱-LD、AST及其同工酶、CK-MM亚型(3)肝酶谱-ALT、LD、-GT、ALP、ChE、MAO(4)肿瘤酶谱-ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS(5)胰酶谱-AMY及其同工酶、LPS、弹力蛋白酶-1、磷脂酶A2,（三）血清酶的临床应用,二、尿液酶三、浆膜腔积液酶四、脑脊液酶,五、同工酶的诊断价值,LD同工酶心肌梗死、肝功能损伤和恶性肿瘤CK同工酶心肌梗死、肌肉疾病和神经系统疾病AST同工酶肝脏、心肌等细胞损伤程度的判断GP同工酶急性心肌梗死ARS同工酶膀胱癌ALD同工酶肝脏疾病、心肌梗死、神经肌肉系统疾病和恶性肿瘤-GT同工酶肝脏占位性病变AMS同工酶急性胰腺炎、腮腺炎ALP同工酶肝胆疾病、骨骼疾病ACP同工酶前列腺疾病GST同工酶肝脏疾病、肺癌,1、转氨酶及其同工酶DeRitis比值（ASTALT）对于急、慢性肝炎的诊断、鉴别诊断以及判断转归也有特别价值。急性肝炎时比值1，肝硬化时比值2，肝癌时比值3。“酶胆分离”现象重症肝炎时由于大量肝细胞坏死，血中ALT逐渐下降，而胆红素却进行性升高，常是肝坏死的前兆。,2、-谷氨酰转移酶及其同工酶-GT同工酶分为-GT1、-GT2、-GT3和-GT4四种，正常人只见-GT2和-GT3。重症肝胆疾病和肝癌时常有-GT1出现，乙醇性肝坏死和胆总管结石时常有-GT2增加，-GT4与胆红素增高密切相关。,3、肌酸激酶及其同工酶和亚型,在细胞质内存在3种同工酶，即CK-BB(CK1)，CK-MB(CK2)和CK-MM(CK3)。在细胞线粒体内还存在另一CK同工酶，即所谓线粒体CK(CK-Mt)，也称CK4。CK-MM亚型测定对早期AMI的检出更为敏感，一般以CK-MM3CK-MMl10作为诊断AMI的标准CK-MB2亚型在AMI早期诊断和判断有无再灌注上有很高的灵敏度和特异性。一般CK-MB219UL或CK-MB2CK-MB115可作为AMI的诊断标准之一。,4、乳酸脱氢酶及其同工酶,AMI时，LD由于分子量较大，在常用心肌酶中升高最迟，通常在梗死8-18h升高，48-144h达峰值，可显著升高(5ULN)，因其半寿期较长，增高持续时间可达5-10d，此时其他酶已恢复正常，在亚急性心肌梗死诊断上有一定价值。测定血清及胸腹水中LD含量常用来鉴别其为漏出液抑或渗出液，若胸水LD血清LD0.6、腹水LD血清LD0.4为渗出液，反之为漏出液。骨骼肌和肝细胞损伤时常出现LD5LD4。急性肝炎时LD1和LD2相对下降，LD5升高；慢性肝炎时LD5升高，且LDlLD3；肝硬化时仅表现LD2下降和LD5升高；肝癌时LD5升高，但LD1LD3。恶性肿瘤如转移到肝脏往往伴有LD4、LD5升高。,5、碱性磷酸酶及其同工酶,人体各组织ALP同工酶可分为3大类，即胎盘ALP、肠ALP和肝骨肾ALP同工酶。肝硬化、胆石症和肿瘤引起的胆汁淤积，ALP增高达ULN的520倍。90以上的肝外胆道阻塞患者血清ALP升高，升高的程度常和阻塞程度及病程成正比。胃肠道肿瘤；肺癌等恶性肿瘤时出现类肠型ALP，称为Kasahara同工酶和类胎盘同工酶称为Regan或Nagao同工酶。,6、酸性磷酸酶及其同工酶,ACP同工酶分前列腺ACP(PAP)和非前列腺ACP(如红细胞ACP、溶酶体ACP、破骨细胞或吞噬细胞ACP等)两大类，在前列腺中含有丰富的PAP。ACP及其同工酶测定主要用于诊断前列腺癌。,7、淀粉酶及其同工酶,根据脏器来源分为胰型同工酶(P-AMY)和唾液型同工酶(S-AMY)，两者再可用醋酸纤维薄膜电泳进一步分成Pl、P2、P3、S1、S2和S3等同工酶亚型。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳区带命名为17，其中1、2、4、6四条区带属于P-AMY，3、5、7三条区带属于S-AMY。血清中有时可出现巨淀粉酶，该酶可能是由S-AMY与IgG或IgA等聚合而成。人体胰腺和腮腺组织损伤时，血清和尿中的总AMY可显著增高，尿AMY约于发病后12-24h开始升高，下降也比血清AMY慢，因此在急性胰腺炎后期测定尿AMY更有价值。,8、脂肪酶,血清中LPS主要来自胰腺，少量来自胃肠粘膜。由于血清LPS在急性胰腺炎时活性升高的时间早，上升的幅度大，持续的时间长，故其诊断价值优于AMY。凡血清AMY升高的病例，其LPS均升高；而LPS升高者