彗星实验要点

1、凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。朋友们如果有异议，请不吝赐教，也对我有所帮助。 2、 解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时 3、一般100ul0.5低熔点胶中含400个细胞就足够了 4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看/bbs/post/view?bid=66&id=&sty=1&tpg=1&age=0 5、注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单 6、首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。其次，您的染色液量我觉得多了点，我用2ug/ml，1ml注射器1滴就可以。第三，要忠于实验结果，图象内容不能更改，可以用ACDSEE或PHOTOSHOP转换图象格式或大小，所以，作出来的实验图象质量要好 7、。背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影响不是很大，如果图片背景乱七八糟，那背景框的选择肯定对结果产生很大影响。我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。注意，背景框可以在细胞的上面或下面，如果背景框在上面时，分析后的图像（分析后出现一个头、尾分明的图像，是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了。背景框的选择关键在于分析同一批细胞，背景框要相同，才能保持资料的可比性。结果的保存，记得好像使用说明里提到了，如果没有提到，那就是我原创的！呵呵，先卖个关子。FILE菜单下有一个EXPORT RESULTS（输出结果）的按钮，点击以后，默认是.TXT文本文件，好了，给你的输出文件起个名字，选择保存位置，点击确定就OK了，回到你保存的输出结果文件，发现它是一个不可识别的文件，那就直接把它的扩展名改成.TXT，打开它，看看你的结果，包括13个指标，很好，这个.TXT的结果文件可以被SPSS统计软件直接识别，不是很方便吗？（如果你愿意把数据一个一个地输入统计软件，我也没意见，呵呵）。这里还有一个小窍门，在用SPSS读取之前，最好把你的结果文件调整一下，这也是我发现的。把所有的指标都排列到第一行，下面的结果要和指标一一对应，每个数据之间留空格（默认的），行与行之间不要用回车，就是不要有空行，其实调整起来很简单，主要是调节.TXT文本文件阅读框的宽度。调好后，SPSS软件直接识别，很方便，为你节省很大工作量，不信就试试。 8、我用双层铺胶法，自制微电泳槽，第一层:0.75正常熔点胶，100l，第二层：0.75低熔点胶，75l+25l淋巴细胞悬液，用枪直接把凝胶吹到自制的微电泳槽中，铺平即可。第二层以相同的方法铺到第一层上面，不必担心脱胶的问题。9、盖玻片用普通的就可以了，但是可以自做的，普通的盖玻片其实有点小了，如果胶很多的话，第二层胶非常厚，这样不利于观察细胞，而且不利于电泳。3。染色后要用双蒸水冲洗，据我的经验，冲要冲的非常干净，否则背景太亮了，拍照后不容易分析。但是又不能使劲的冲，否则胶很容易掉下来。4。电泳的时间一般是20分钟，电压各个细胞是不同的，你可以查查有关资料，自己做做预试验。一般情况下，对照组的细胞的tail DNA%应为10%左右，不超过20%，如果尾巴太短了，也不好。5。分析要用荧光显微镜的，具体的染液，有不同的激发波长。casp软件在前面的帖子中就有。很好用的，在推荐一次哦。最好用显微镜自带的相机，如果你的技术好的话，可以在目镜照相，洗出来扫描后可以分析的。6.把EB滴加在胶上就可以了。观察时要在暗室里。 我是用EB的，电泳后，直接在胶板上滴上一滴，然后用水冲洗，用滤纸吸去多余水分，荧光显微镜观察10、SCGE技术的原理：细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA残留而形成类核。如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。11、H2O2是作为阳性对照的吧？它是标准的断裂剂。但是不同的细胞对它的敏感程度是不同的，我觉得前几个数据有必要删掉，30微摩尔以下的浓度应该是会造成断裂的。PI染色我见过，染出来的效果也是很不错，是蓝色的。不一定用EB染色呀，毒性又大。12、单细胞琼脂糖凝胶电泳（comet assay）Single Cell Agarose Gel Electrophoresis (SCGE)步骤：一、 细胞悬液的制备：1. 吸弃旧培养基，D-Hanks冲洗2遍2. 0.25%胰酶消化，待细胞变圆，间隙增大，立即终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞，使成细胞悬液，加入离心管，1000rpm，离心10min，弃上清，以1mlD-Hanks悬浮细胞，以上应在暗室及较低温度下进行。各组收集细胞23106个，必须分散成单个。悬浮于1mlPh7.4PBS中，此步在暗室及较低温度下进行。二、玻片制备：1. 玻片磨砂。2. 制备0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.5%低熔点琼脂糖(LMPA)各20ml。用pH7.4 PBS配制。称0.1g溶于20mlPBS，如NMA与玻片附着不紧，可升高其浓度至0.65%。铺第一层胶：0.5%NMPA 100l于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，室温5min使其固化，即为第一层胶；第二层胶：37 0.5%LMPA 100l+30-50l（1-2x106）细胞悬液(10:1)混匀，迅速铺于第一层胶上，盖新盖玻片，移入冰箱5min，使其固化。* 余下的细胞1000g10min离心，于0.1-0.2ml悬浮缓冲液中混匀，做Western-blot。三、细胞溶解：1. 玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉细胞溶解液中，41小时或过夜。玻片在细胞消化液中可至少存放4周。细胞溶解液配制NaCl 146.1 gNa2EDTA 37.2 gTris base 1.2 g用约12克NaOH调节pH至10。用去离子水定容至890ml。过滤除菌，为贮备液。室温保存。应用液加入 Triton X-100 至 1%DMSO 至 10%（消除血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的自由基）应用前冷藏3060分钟。4、碱化处理及电泳：取出玻片，放入水平电泳槽中(正极端)，并列放置，不留空隙。倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液，高于胶2mm，无气泡。放置1030分钟，本室一般采用15min，使DNA解链。25V, 300mA电泳20分钟。通过调节液面来调电压。(电压先调到最大，电流300mA然后通过液面来调节电压)电泳缓冲应用液：10N NaOH 30.0 ml（12克）200mM EDTA 5.0 ml （二钠为0.372g）(附言：电泳缓冲液储备液：10N NaOH 200g/500ml水，两周内用。200mM EDTA 14.89g/200ml水，pH=10,室温保存。）定容至1000ml，混匀，电泳前新鲜配制。可通过改变液面高度来调节电压。5、中和：切断电源，取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次5min。中和缓冲液：Tris base 48.5 g去离子水 定容至1000ml用10 N HCl调节pH至7.5。室温保存。6、染色呈中性后，凉干玻片，50l EB应用液染色，盖上新盖玻片。EB染色液(10贮备液)EB 1 mg 去离子水 20 ml 室温避光保存。临用时将贮备液稀释10倍。使终浓度为5g/ml以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤。7、镜检及结果评价EB染色后的DNA样品应尽快在荧光显微镜下观察。未受损细胞表现为以圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。受损细胞则有彗尾伸向阳极，形成一个亮的头部和尾部。用目镜测微尺或拍摄400倍照片再作判断。每个样品中至少随机挑选25个细胞测定。彗星尾长度 70m为重度损伤 裂解液中，最难溶解的是SLS,它在中性的时候不易溶于水，所以你把其他的药品加进去后，先不要加SLS，这里需要磁力搅拌器搅拌，但是时间不会很长。溶解后，用NaoH把PH调到10，这里调PH值要用NaoH固体，然后把SLS加进去，在用磁力搅拌器搅拌，一般需要加热，50度左右就可以了。大约搅拌1个小时就可以溶解。这时，溶液应该是透明的，不是乳白色的。加热溶解的过程中，可能会损失一定的水分，等搅拌完了后，你要把溶液的量补充到你最后需要的体积。当你从冰箱中取出裂解液后，裂解液如果有沉淀，你就把它放在37度水浴中让它充分溶解，然后把DMSO和Triton-100加进去，这时，还是乳白色的，你把他放在37度中放一会就可以了。注意，溶液的颜色是透明清亮的，浑浊的话，不能起到裂解的效果，最后跑不出彗星来。中性条件跑出来的是DNA的双链，单链断裂不会出来，而强碱性条件下，破坏了断裂部位连接碱基的氢键，这样，双链断裂也就成了单链形式，可以说碱性检测的是“双链和单链断裂的综合损伤”，两种电泳条件的最大区别是适用于不同的实验需求。碱性条件的SCGE的建立也是为了满足不同实验需要。实践中要根据DNA致伤因素选择实验条件，如：电离辐射对DNA的损伤以双链断裂为主，应该选择中性SCGE，而且可以排除环境因素对DNA损伤的影响（因为DNA很容易受到环境因素的影响而断裂单链为主），如果用碱性的话，就不能区分哪些是实验因素引起的断裂，哪些是其它影响因素引起的断裂。如果实验致伤因素是以DNA单链为主，那就应该选择碱性SCGE了。有一点需要说明一下，碱性SCGE确实增加了检测的敏感性（中性SCGE达不到），但牺牲了特异性，DNA很容易受许多因素的影响而产生断裂，如吸烟、饮酒等不良生活习惯、环境污染等因素。所以碱性条件很难从实验结果中剔除哪些是非实验致伤因素造成的，对实验结果会或多或少有点影响。所以说SCGE条件的选择主要还要根据实验的需要来定。我在下面这个帖子里说的“碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台”这句话是相对中性SCGE而言的，因为碱性SCGE的检测敏感范围要比中性SCGE的敏感范围低，即碱性在小剂量范围敏感（灵敏到0.05Gy），中性SCGE在较大剂量范围敏感。（我已经在这个帖子里做了相应的强调修改），科研工作者非常需要littlesheep04这样一丝不苟的精神（钦佩！），在科研中甚至要作到“斤斤计较”，这样才容易发现问题，许多没有结果的实验找不到问题那岂不是很悲哀？呵呵，看来对某一句话的理解还要考虑语境啊，“碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台”这句话如果单拿出来的话，它本身的描述不够准确，应该是某些指标（如长度指标TL、CL）容易形成平台，中性SCGE也有这个问题，而矩类指标不会出现平台（当然，哪个指标都会有它的敏感检测范围），这样，这句话的目的就是说明矩类指标优于长度指标的。呵呵，脱离了语境，某句话的目的也就大不相同了。我做彗星的几点体会：1 正常熔点琼脂糖我用的0.6%，低熔点我用的0.7%。2 把普通载玻片拿去玻璃厂磨成磨砂玻片，也不贵。磨几百张肯定够用了。3 我通常在烧杯里配100ml左右的正常熔点琼脂糖，煮沸之后把磨砂玻片放进去，让胶液浸过磨砂面之后，捞出玻片，用布或者别的什么把光滑面擦干，然后把玻片