生物化学实验课件.ppt

生物化学实验,实验一糖类的性质实验（实验一和二）实验二氨基酸的分离鉴定-纸层析法（7）实验三蛋白质及氨基酸的呈色反应（8）实验四酶的特性（18）实验五脂肪碘值的测定(5)实验六蛋白质的等电点测定和沉淀反应(9)实验七米氏常数的测定(20)实验八维生素C的定量测定(23),实验课是提高教学质量的重要环节。通过实验巩固理论知识，训练基本操作，培养独立工作的能力，为了保证实验顺利进行，实验前应注意以下几点：,实验室规则及安全、卫生教育,1、每次实验前必须详细预习实验讲义，明确实验原理及操作步骤，并在记录本上拟出操作时的注意事项。2、实验时自觉遵守课堂纪律，严格按操作规程操作，既要独立操作又要与其他同学配合。3、实验时应严格按照实验步骤及试剂用量进行操作，不能任意变更。不熟悉的仪器和设备，应先请老师讲解后使用，切勿随意乱动。,4、实验进行时，必须随时把观察得到的现象和实验数据，如实地记录在记录本上，不得记录在其他纸上，要养成作原始记录的良好习惯。5、实验时如有问题发生，应首先用自己学过的知识，独立思考加以解决，培养独立分析问题和解决问题的能力，如自己不能解决，可与指导老师共同讨论研究，提出解决问题的办法。6、精心爱护各种仪器。实验所需的一般仪器按规定借领，归还。完成实验后应将仪器洗净倒置于实验柜中并排列整齐。如有损坏或遗失，需要说明原因，经指导教师签名后方可补领，并按规定赔偿。,7、精密贵重仪器每次使用后应登记姓名并记录仪器使用情况。要随时保持仪器的清洁。如发生故障，应立即停止使用并报告指导教师。8、验中所用得玻璃仪器及其它器皿，应洗涤干净，桌面、地面要保持清洁有序，实验完毕后，所用仪器设备应恢复原状。,9、必须遵守实验室规则：（1）室内不得高声谈笑，保持安静的实验环境。（2）爱护仪器，不得浪费药品，节省水电，遵守学生守则及实验室安全、卫生等制度。（3）公用仪器及试剂瓶用完后应及不要移动原有的位置。注意瓶塞切勿盖错，以免污染试剂，用毕后立即放回原处。对于有害药品，应按实验室规定取用。（4）滤纸、火柴棒、碎玻璃等应投入废品袋，切勿丢入水池，以保证下水道畅通。,（5）如用仪器有损坏，立即向指导老师报告，再行登记。（6）保持实验室的整齐清洁，个人所带与实验无关的东西，如书包等要放在实验室指定地方，不得乱放在实验桌上。（7）由学生轮流值日，值日生要负责当天实验室的卫生、安全和服务性的工作，特别注意打扫水槽中废弃物。（8）最后一组实验人员，离开实验室时，检查水、电、门、窗是否关闭，以保证实验室安全。（9）如有突发事件（起火、试剂腐蚀伤人）发生，不要惊慌失措，应妥善处置（使用灭火机、关闭电源等）。,实验一糖类的性质实验,糖类的重要鉴别方法是反应和反应。糖类、苷类及其他含糖物质与萘酚和浓硫酸呈紫红色的环的反应称为反应，该反应可用于糖类和非糖物质的鉴别。酮糖糖加入间苯二酚和盐酸能产生红色的反应称为反应，该反应可用于酮糖和醛糖的鉴别。如己酮糖加入间苯二酚和浓盐酸，加热后迅速产生红色，而同样条件下己醛糖的反应速度要慢得多。,非还原性糖在酸存在下，加热水解后产生还原性的单糖。淀粉的水解是逐步发生的，先水解成紫糊精，再水解成红糊精、无色糊精、麦芽糖，最终水解成葡萄糖。用碘液可以检查这种水解过程。完全水解后，可用试剂加以证实。多糖类遇浓硫酸被水解成单糖，单糖被浓硫酸脱水闭环，形成糠醛类化合物，在浓硫酸存在下与萘酚发生酚醛缩合反应，生成紫红色缩合物。,一、实验目的：1、了解糖类某些颜色反应的原理；2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法；3、学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及其原理。,二、实验原理(一)颜色反应1.-萘酚反应糖在浓无机酸（硫酸或盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与-萘酚生成紫红色物质。注意：因糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，不是糖类的特异反应。,O,CHO,-CH2OH,2.间苯二酚反应在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。因为醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。,(二)还原作用许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定。本实验所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是Cu2的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色（颗粒大）或黄色（颗粒小）的Cu2O沉淀。本尼迪克特试剂是改良的斐林试剂。（见P100,101脚注）,三、器材及试剂1、器材：试管、试管架、滴管、水浴锅（或电炉）2、试剂：1%葡萄糖溶液，1%果糖溶液，1%蔗糖溶液，1%淀粉，1%麦芽糖溶液，0.1%糠醛溶液，浓硫酸，莫氏试剂，塞氏试剂，斐林试剂，本尼迪克特试剂,四、实验步骤1、-萘酚反应1%葡萄溶液1%果糖溶液各加1ml各加2滴各加1ml1%蔗糖溶液莫氏试剂浓硫酸1%淀粉溶液0.1%糠醛溶液,5支试管,混匀,观察记录各管颜色,Molisch反应（-萘酚反应）,浓H2SO4,界面：显色-,鉴定：所有的糖类均可显色,2.间苯二酚反应1%葡萄糖溶液各加0.5ml各加5ml1%果糖溶液赛氏试剂1%蔗糖溶液,3支试管,混均,同时置沸水浴中,观察记录各管颜色,3、糖与斐林试剂的反应1）检验试剂：,1ml斐林试剂或1ml本尼迪克特试剂,4ml蒸馏水,1支试管,加热煮沸,观察现象,2）实验过程2ml斐林试剂1%葡萄糖溶液各加1ml1%果糖溶液或1%蔗糖溶液1%麦芽糖溶液2ml本尼迪克特1%淀粉溶液试剂,5支试管,观察记录各管颜色,置沸水浴中加热,取出冷却,五、实验数据记录（P99,102）六、实验思考题：1.可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？2.-萘酚反应的原理是什么？3.斐林试剂、本尼迪克特试剂检验糖的原理是什么？七、预习：P109实验二,实验二脂肪碘值的测定,实验时取样多少决定于油脂样品的碘值。可参考表1与表2：,一、实验目的1、学习和掌握测定脂肪碘值的原理和方法。2、了解和学习空白对照实验的原理和方法,教材第6、7页,二、实验原理碘值（价）是指100g脂肪在一定条件下吸收碘的克数。碘值是鉴别脂肪的一个重要常数，可用以判断脂肪所含脂肪酸的不饱和程度。脂肪中常含有不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸具有一个或多个双键，能与卤素起加成作用而吸收卤素。,常用碘与脂肪中不饱和脂肪酸的双键起加成作用。脂肪的不饱和程度越高，所含的不饱和脂肪酸越多，与其双键起加成作用的碘量就越多，碘值就越高。故可用碘值表示脂肪的不饱和度。I2+CH=CHCHICHI,本实验用溴化碘(Hanus试剂)代替碘。用一定量(必须过量)溴化碘和待测的脂肪作用后，用硫代硫酸钠滴定的方法测定溴化碘的剩余量，然后计算出待测脂肪吸收的碘量，求得脂肪的碘值。,加成作用：IBr+CH=CHCHICHBr剩余溴化碘中碘的释放：IBr+KIKBr+I2再用硫代硫酸钠滴定释放出来的碘：I2+2Na2S2O32Na2S4O6+2NaI,三、器材及试剂1、器材：碘瓶，量筒，滴定管，吸量管，滴管，分析天平2、试剂：花生油，Hanus试剂,四氯化碳，10%碘化钾溶液0.05%mol/L硫代硫酸钠溶液，1%淀粉溶液,四、实验步骤0.3-0.4g油两份洁净碘瓶加入10ml四氯化碳轻轻振动加入Hanus试剂25ml塞好瓶塞，并在塞子与瓶口间加入数滴KI溶液混匀置暗处30分钟打开瓶塞，将KI流入瓶内加入KI10ml和蒸馏水50ml,将瓶塞和瓶颈上的液体冲入瓶内混匀用0.1ml/L的Na2S2O3滴定至淡黄色加入1%淀粉溶液约1ml继续滴定至接近滴定终点(蓝色极淡)加塞用力振荡再滴至滴定终点（水层与非水层全部都无色）另外再做一份空白实验。(除不加样品外，其它操作同样品实验。),附注（1）碘瓶必须洁净、干燥，否则油中含有水分，引起反应不完全。（2）加碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变浅褐色时，表明试剂不够，必须再添加1015mL试剂。（3）如加入碘试剂后，液体变浊，这表明油脂在CCl4中溶解不完全，可再加些CCl4。（4）将近滴定终点时，用力振荡是本滴定成败的关键之一，否则容易滴加过头或不足。如震荡不够，CCl4展会出现紫或红色，此时应用力振荡，使碘进入水层。（5）淀粉溶液不宜加得过早，否则滴定值偏高。,五、实验结果记录1、原始数据记录1）花生油的质量W值2）Na2S2O3摩尔浓度C值,2）滴定结果记录：A为滴定空白所消耗的Na2S2O3溶液mL数；B为滴定样品所消耗的Na2S2O3溶液mL数；c为Na2S2O3溶液的摩尔浓度。最后求出平均碘值。,六、思考题：1、何谓碘值？具有什么意义？2、何谓空白溶液和空白实验？空白实验有何意义？七、预习：P122实验三氨基酸的分离鉴定-纸层析法,一、层析技术简介,层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。,层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。,二、层析的分类,1、按分离相状态分类：根据层析过程中的固定相和流动相进行分类，大致可以分以下几类：（1）气相层析是以气体为流动相的层析方法，称之为气相层析。根据固定相的性质不同又可以分为气-固层析(GSC)和气-液层析(GLC)。前者是指载体表面含有许多吸附基团的固体吸附介质，后者是指载体表面涂有一层薄薄液体分子制成的介质。,（2）液相层析是以液体为流动相的层析方法，称之为液相层析。同理，根据固定相的性质不同又可以把液相层析分为液-固层析(LSC)和液-液层析(LLC)。液相层析的固定相性质与气相层析相近。（3）超临界层析是以流体为流动相的层析方式，称为超临界层析(SFC)。它是利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点的条件下进行分离的，这种分离方法更具专一性。,2、按层析的分离机理分类（1）排阻层析利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为排阻层析。,（2）离子交换层析利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。,（3）吸附层析利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。,（4）分配层析,被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和解吸附的作用，在移动的过程中物质在两相之间进行分配。利用被分离物质在两相中分配系数的差异而进行分离的一种方法，称之为分配层析。,（5）亲和层析在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。,（6）金属螯合层析利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。,（7）疏水层析,利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。,（8）反向层析利用固定相载体上偶联的疏水性较强的配基，在一定非极性的溶剂中能够与溶剂中的疏水分子发生作用，以非极性配基为固定相，极性溶剂为流动相来分离不同极性的物质的方法，称之为反相层析。（9）聚焦层析利用固定相载体上偶联的载体两性电解质分子，在层析过程中所形成的pH梯度，并与流动相中不同等电点的分子发生聚焦反应进行分离的方法，称之为聚焦层析。,（10）灌注层析利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿孔与流动相中溶质分子分子量的差异进行分离的方法，称之为灌注层析。,实验三氨基酸的分离鉴定-纸层析法,氨基酸的分离鉴定-纸层析法一、实验目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法,二、实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。(其原理参见P33)层析溶剂由有机溶剂(或称有机相，是流动的、被水饱和的，构成流动相)和水(通常是被结合在滤纸上，构成固定相)组成。(P34纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间,纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相，由于纤维素与水的氢键作用，使水不易扩散，并能与跟水混合的溶剂(有机相)形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。,物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的：原点到层析点中心的距离Rf原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数，Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量、展层方式、层析温度和pH等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。,三、器材及试剂1、器材：层析缸（或标本缸），毛细管，喷雾器，电吹风，培养皿，层析滤纸(质地必须均一、平整及厚薄均匀，要有一定的强度。新华1号或3号滤纸(或Whatman1号或3号滤纸)2、试剂：0.5%的赖氨酸，0.5%的脯氨酸，0.5%的缬氨酸，0.5%的苯丙氨酸，0.5%的混合氨基.酸，显色剂，扩展剂,四、实验步骤1取扩展剂约5ml置于小烧杯中做平衡溶剂，然后将小烧杯置于密闭的层析缸中（或标本缸）。2取层析滤纸（长22cm，宽14cm）一张。在纸的一端距边缘2-3cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一个记号(“”型而不是“.”型)，共作5个记号作为点样点；另外，沿展层方向在滤纸两边距边缘约0.5-1cm处对称地划两条直线，分别将其四等分，各取其三个等分点作为缝线点。,3、点样用毛细管将各种氨基酸样品分别点在这6个点样点位置上(注意速度要快，否则易扩散开)，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。4扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触，将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需要低于点样纸1cm）。待溶剂上升15-20cm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或者用吹风机吹干。,5显色用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟（100）或用热风吹干即可以显出个层析斑点。6计算各种氨基酸的Rf值五、实验结果记录,六、思考题：1何谓纸层析法？2何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？3怎样制备扩展剂？预习：实验四蛋白质及氨基酸的呈色反应。P125,实验四蛋白质及氨基酸的呈色反应,一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法,二、实验原理（一）双缩脲反应双缩脲反应:尿素加热至180左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，能发生双缩脲反应。这可用于蛋白质的定性或定量测定。,注意:双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所特有，许多含有一个肽键和一个氨基的物质也能发生此反应如CS-NH2，-CH2-NH2，O=CC=O等。NH2NH2NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子(Cu(NH3)42+，四氨合铜)。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。,（二）茚三酮反应除脯氨酸，羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。,-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应(尿素、马尿酸和肽键上的亚氨基不呈现此反应。)因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定是蛋白质或氨基酸。在定性定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。,茚三酮反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳，氨和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮。第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。(此反应的适宜pH为5-7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同的pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。),（三）黄色反应含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。(多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，注意苯丙氨酸不易硝化，需加入少量的浓硫酸才有黄色反应，该反应非常灵敏。),（四）考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。(它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍，反应速度快，约在2分钟达到平衡，在室温1小时内稳定，常用来定量测定蛋白质含量),三、器材及试剂1、器材：电炉、试管、试管架、吸管、吸管架等2、试剂：尿素,1%CuSO4溶液，10%NaOH溶液2%卵清蛋白溶液，0.5%甘氨酸溶液，0.1%茚三酮水溶液，0.1%茚三酮乙醇溶液，0.5%苯酚溶液，浓硝酸，0.3%色氨酸0.3%酪氨酸溶液，考马斯亮蓝染液。,四、实验步骤双缩脲反应取少量尿素结晶于干燥试管中微火加热熔化硬化时停止加热冷后，加10%NaOH溶液约1ml振荡混匀加一滴1%CuSO4溶液再振荡观察记录另取一只试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%NaOH溶液约2ml摇匀加1%CuSO4溶液2滴随加随摇观察记录,茚三酮反应(1)取两支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各1ml再各加0.1%茚三酮水溶液0.5ml混匀沸水浴中加热12分钟观察(2)在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液风干在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液微火旁烘干显色观察,黄色反应向6支试管中分别按下表加入试剂，观察各试管出现的现象，待各管出现黄色后，与室温下逐滴加入10%NaOH溶液至碱性，观察颜色变化。,考马斯亮蓝反应取2支试管，按下表操作：,五、实验结果记录见P131-132表六、思考题：通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理是什么？七、预习：P133实验五蛋白质等电点测定和沉淀反应,实验五蛋白质的等电点测定和沉淀反应,一、实验目的1、了解蛋白质的两性解离性质；2、学习测定蛋白质等电点的方法；3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义；5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。,二、实验原理(一)蛋白质的等电点的测定蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡(见P133图)。COOHP(蛋白质分子)NH2COO-COO-COOHPPPNH2NH3+NH3+阴离子兼性离子阳离子pHpIpH=pIpHpI电场中：移向阳极不移动移向阴极,+H+,+H+,+OH-,+OH-,蛋白质的等电点(pI)：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液酸碱度的影响，当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点(pI)。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低(或沉淀量最多)时的溶液pH值。本实验借观察不同pH缓冲液中溶解度以测定酪蛋白的等电点。,(二)蛋白质的沉淀及变性在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可以分为两类：(1)可逆的沉淀反应(不变性，如盐析作用或低温作用下用乙醇或丙酮短时间作用)(2)不可逆的沉淀反应(变性，如加热沉淀与凝固、与重金属离子或某些有机酸反应等),(注意：蛋白质变性后，由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性),三、器材及试剂1、器材：水浴锅温度计容量瓶锥形瓶吸管试管吸管架试管架2、试剂：0.4%酪蛋白醋酸钠溶液：1.0mol/L醋酸溶液,0.1mol/L醋酸溶液，0.01mol/L醋酸溶液，蛋白质溶液，pH4.7HAc-NaAc的缓冲溶液，3%硝酸银溶液，5%三氯乙酸溶液，乙醇，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵结晶粉末，0.1mol/L盐酸溶液，0.1mol/L氢氧化钠溶液，0.05mol/L碳酸钠溶液，甲基红溶液，2%氯化钡溶液,四、实验步骤(一)蛋白质的等电点的测定1、取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确的加入各试剂，然后混匀。(注意：在测定等电点实验中，要求各种试剂的浓度和加入量相当准确),2、向以上各试管加酪蛋白的NaAc溶液1mL(加一管，摇匀一管)。此时1，2，3，4管的pH依次为5.9，5.3，4.7，3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度(最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点)。,(二)蛋白质的沉淀及变性1、蛋白质的盐析：无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。(如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出)蛋白质溶液5mL于试管中加5mL饱和硫酸铵混均静置数分钟倒出少量沉淀加少量水观察是否溶解(？),2、重金属离子沉淀蛋白质(重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物)取蛋白质溶液2mL于试管中加3%硝酸银溶液1-2滴振荡放置片刻倾去上清液向沉淀中加入少量水观察是否溶解(？),3、某些有机酸沉淀蛋白质(PhpI)蛋白质溶液2mL于试管中加5%三氯乙酸溶液1mL振荡放置片刻观察现象倾去上清液向沉淀中加入少量水观察是否溶解(？)4、有机溶剂沉淀蛋白质(蛋白质脱去水化层，降低介电常数)蛋白质溶液2mL乙醇2mL振荡观察沉淀？,5、乙醇引起的变性与沉淀取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：,五、实验结果记录：见P140-142六、思考题：何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实用意义？七、预习：实验六酶的特性(P169),实验六酶的特性,一、实验目的加深对酶的性质的认识二、实验原理（一）温度对酶活力的影响：酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。(大多数动物酶的最适温度37-40，植物酶的最适温度为50-60。)高温可以使酶失活，低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。,酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100，其活性并无明显改变，但在100的溶液中却很快地完全失去活性。淀粉被唾液淀粉酶水解的产物有糊精和麦芽糖。淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色、不呈色。麦芽糖遇碘也不呈色。因此，在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。,（二）pH对酶活性的影响：酶的活力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。(三)唾液淀粉酶的活化和抑制：酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为唾液淀粉酶的抑制剂。(四)酶的专一性：酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。(淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解淀粉最终生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解生成还原性的葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。用本尼迪克特试剂检查糖的还原性。),三、器材及试剂1、器材：试管及试管架恒温水浴锅吸管滴管锥形瓶电炉石棉网烧杯冰块塑料盆2试剂：0.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液(新鲜配制)；0.5%淀粉的0.3%NaCl溶液(新鲜配制)；1%淀粉的0.3%氯化钠溶液(新鲜配制)；稀释200倍的唾液(新鲜配制)；KI-I2溶液(用前稀释10倍)；0.2mol/LNa2HPO4溶液；0.1mol/L柠檬酸溶液；四种pH试纸(pH=5、pH=5.8、pH=6.8、pH=8)；0.1%的淀粉溶液；1%NaCl溶液；1%CuSO4溶液；1%Na2SO4溶液；2%蔗糖溶液；蔗糖酶溶液,四、实验步骤（一）温度对酶活力的影响取3支试管，编号，按下表加入试剂：,摇匀,1,3号管,37水浴,2号管,冰水浴,10分钟,一半,一半,加KI-I2,37水浴10分钟,加KI-I2,记录现象,现象,（二）pH对酶活性的影响1、配制缓冲液：取4个50mL锥形瓶，编号，用吸管按P171表添加0.2mol/LNa2HPO4和0.1mol/l柠檬酸溶液以制备pH5.0-8.0的4种缓冲液（PH5.0、PH5.8、PH6.8、PH8.0）2、过程,取4支试管,编号,pH缓冲液3mL,0.5%淀粉2mL,间隔1min加已稀释200倍的唾液2mL,混匀,依次于37水浴中保温,每隔1分钟用白瓷板检验H6.8的试管淀粉水解程度,各管间隔1min加1-2滴KI-I2溶液,观察各管颜色变化,2分钟,显示棕黄色后,检验方法:待向第4管加入唾液2min后，每隔1min由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴KI-I2溶液，检验淀粉水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1-2滴KI-I2溶液。,(三)唾液淀粉酶的活化和抑制取4支试管，编号，按下表加入各试剂：解释结果，说明本实验第3管的意义。(注意：保温时间可根据各人唾液淀粉酶活力调整。),(四)酶的专一性：1、淀粉酶的专一性(见P174表)(注意：唾液中除含淀粉酶外还含有少量的麦芽糖酶)2、蔗糖酶的专一性(见P175表，与上表区别在于37恒温水浴中保温5min),五、实验结果记录：见P175-177六、思考题：1、什么是酶的最适温度和最适pH？2、什么是酶的活化剂？、什么是酶的抑制剂？与变性剂有何区别？3、本实验结果如何证明酶的专一性？预习：实验七米氏常数的测定(P181),实验七米氏常数的测定,一、实验目的1、了解底物浓度对酶促反应速度的影响。2、学习测定米氏常数（Km）的原理和方法。,VmaxS,Km+S,1,v,Km,1,1,Vmax,S,Vmax,V=,二、实验原理米氏方程:改为双倒数式：=+,1,v,Km,1,1,Vmax,S,Vmax,=+,Km值是酶的一个特征常数，测定Km值是酶学研究中的一个重要方法。双倒数作图法是实验方法测定Km值的最常用的比较方便的方法。实验时选择不同的S，测定相对应的V，求出两者的倒数，以1/V对1/S作图，则得到一斜率为Km/Vmax的直线。将直线外推与横轴相交，由1/Km=-1/S求出Km。,本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法测定Km值。胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基，因此可以用甲醛滴定法(原理参见P148)判断自由氨基增加的数量来追踪反应。,三、器材及试剂1、器材：锥形瓶碱式滴定管滴定台蝴蝶夹吸管量筒恒温水浴锅2、试剂：pH8.5酪蛋白溶液(10、20、30、40g/L)；40g/L胰蛋白酶溶液；纯甲醛溶液；酚酞(2.5g/L乙醇)；标准NaOH(约0.1mol/L)溶液,四、实验步骤1、6个小锥形瓶分别加入2.5mL甲醛溶液和1滴酚酞分别滴加0.1ml/LNaOH溶液至混合物呈为微粉红色(所有瓶中颜色须一致)2、另取一大锥形瓶加入30mL酪蛋白溶液37水浴保温10min（同时胰蛋白酶溶液也37水浴中保温10min）,3、精确地取5mL酶液加到酪蛋白溶液中，同时记时充分混合随即取5mL反应混合物(作为0时样品)吹至上述含甲醛的小锥形瓶中各加入酚酞（1滴酚酞/ml混合液）用0.1mol/LNaOH滴定至呈微弱但持的粉红色在接近终点时，再加入指示剂(每mLNaOH溶液加入1滴酚酞)继续滴定至终点记下所消耗NaOH的mL数4、在2、4、6、8和10min时分别取出5mL消化样品，准确地照上法操作，在每一个样品中滴定终点的颜色应当是一致的，用增加的滴定度对时间作图，测定初速度。,5、用不同浓度的酪蛋白溶液（10，20，30g/L，40g/L）测定不同底物浓度时的活力。6、用实验测得的结果，以1/V对1/S作图，求出Vmax和Km的数值,五、实验结果记录：1、原始数据记录：不同浓度样品在不同反应时间的NaOH滴定量(m),2、数据处理1)用增加的滴定度对时间(m-t)作图，测定初速度V02)用不同浓度的酪蛋白溶液测定不同底物浓度时的反应初速度。3)以1/V对1/S作图，求出Vmax和Km的数值,六、思考题：1、如何正确测定酶促反应速度？2、由实验所得