保健食品功能学评价程序和检验方法

保健食品功能学评价程序和检验方法1主题内容和适用范围本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的统一程序和检验方法。本程序和检验方法适用于评价食品的免疫调节、延缓衰老、改善记忆、促进生长发育、抗疲劳、减肥、耐缺氧、抗辐射、抗突变、抑制肿瘤、调节血脂、改善性功能等作用。本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的人体试食试验规程。2进行食品保健作用评价的基本要求2.1对受试物的要求2.1.1提供受试物的物理、化学性质(包括化学结构、纯度、稳定性等)等有关资料。2.1.2受试物必须是规格化的产品，即符合既定的生产工艺、配方及质量标准。2.1.3提供受试物安全性毒理学评价的资料，受试物必须是已经过食品安全性毒理学评价确认为安全的物质。2.2对实验动物的要求2.2.1根据各种试验的具体要求，合理选择实验动物。常用大鼠和小鼠，品系不限，推荐使用近交系动物。2.2.2动物的性别不限，可根据试验要进行选择。动物的数量的要求为小鼠每组至少10只（单一性别），大鼠每组至少8只(单一性别)。动物的年龄可根据具体试验要而定。2.2.3动物应达到二级实验动物的要求。2.3给受试物的剂量及时间2.3.1各种试验至少应设3个剂量组，1个对照组，必要时可设阳性对照组。剂量选择应合理，尽可能找出最低有效剂量。在3个剂量组中，其中一个剂量应相当于人推荐摄入量的510倍左右。2.3.2给受试物的时间应根据具体试验而定，原则上至少1个月。3试验项目、试验原则及结果判定3.1免疫调节作用3.1.1试验项目3.1.1.1.1脏器/体重比值胸腺/体重比值脾脏/体重比值3.1.1.1.2细胞免疫功能测定小鼠脾淋巴细胞转化实验迟发型变态反应3.1.1.1.3体液免疫功能测定抗体生成细胞检测血清溶血素测定3.1.1.1.4单核巨噬细胞功能测定小鼠碳廓清试验小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验3.1.1.1.5NK细胞活性测定3.1.1.2人体试食试验3.1.1.2.1细胞免疫功能测定外周血淋巴细胞转化试验3.1.1.2.2体液免疫功能试验单向免疫扩散法测定IgG、IgA、IgM3.1.1.2.3非特异性免疫功能测定吞噬与杀菌试验3.1.1.2.4NK细胞活性测定3.1.2试验原则要求选择一组能够全面反映免疫系统各方面功能的试验，其中细胞免疫、体液免疫入单核巨噬细胞功能三个方面至少各选择1种试验，在确保安全的前提下尽可能进行人体试食试验。3.1.3结果判定在一组试验中，受试物对免疫系统某方面的试验具有增强作用而对其他试验无抑制作用，可以判定该受试物具有该方面的免疫调节效应；对任何一项免疫试验具有抑制作用可判定该受试物具有免疫抑制效应。在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能及NK细胞功能检测中，如有两个以上(含两个)功能检测结果阳性，即可判定该受试物具有免疫调节作用。3.2延缓衰老作用3.2.1试验项目3.2.1.1动物试验3.2.1.1.1生存试验小鼠生存试验大鼠生存试验果蝇生存试验3.2.1.1.2过氧化脂质含量测定血(或组织)中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定组织中脂褐质含量测定3.2.1.1.3抗氧化活力测定血(或组织)中超氧化物歧化(SOD)活力测定血(或组织)中谷胱甘过氧化物(GSH-PX)活力测定3.2.1.2人体试食试验血中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定血中超氧化物歧化(SOD)活力测定血中谷胱甘过氧化物(GSHPX)活力测定3.2.2试验原则衰老机制比较复杂，迄今尚无一种公认的衰老机制学说，因而无单一、简便、实用的衰老指标可供应用，应采用尽可能多的试验方法，以保证试验结果的可信性。动物试验，除上述生存试验，过氧化脂质含量测定、抗氧化活力测定3个方面各选一项必做外，可能时应多选择一些指标(如脑、肝组织中单胺氧化(MAO-B)活力测定等)加以辅助。生存试验是最直观、最可靠的实验方法，果蝇具有自下而上期短，繁殖快，饲养简便等优点，通常多选果蝇作生存试验，但果蝇种系分类地位与人较远，故必须辅助过氧化脂质含量测定及抗氧化活力测定才能判断是否具有延缓衰老作用。生化指标测定应选用老龄鼠，除设老龄对照外，最好同时增设少龄对照，以比较受试物抗氧化的程度，必要时可将动物试验与人体试食试验相结合综合评价。3.2.3结果判定若大鼠或小鼠生存试验为阳性，即可判定该受试物具有延缓衰老的作用。若果蝇生存试验，过氧化脂质和抗氧化三项指标均为阳性，即可判定该受试物具有延缓衰老的作用。若过氧化脂质和抗氧化两项为阳性，可判定该受试物具有抗氧化作用，并提示可能具有延缓衰老作用。3.3改善记忆作用3.3.1动物试验跳台试验避暗试验穿梭箱试验水迷宫试验3.3.1.2人体试食试验韦氏记忆量表临订记忆量表3.3.2试验原则3.3.2.1试验应通过训练前、训练后及重测验前3种不同的给予受试物方法观察其对记忆全过程(记忆的获得、记忆巩固、记忆再现)的影响。3.3.2.2应采用一组(2个以上)行为学试验方法，以保证实验结果的可靠性。3.3.2.3人体试食试验为必做项目，并应在动物试验有效的前提下进行。3.3.2.4除上述试验项目外，还可以选用嗅觉厌恶试验、味觉厌恶试验、操作式条件反射试验，连续强化程序试验、比率程序试验、间隔程序试验。3.3.3结果判定动物试验2项或2项以上的指标为阳性，且2次或2次以上的重复测试结果一致，可以认为该受试物具有改善该类动物记忆作用；若人体试食试验结果阳性，则可认为该受试物具有改善人体记忆作用。3.4促进生长发育作用3.4.1试验项目3.4.1.1胎仔情况活胎数、雄比例、死胎数、分娩胎仔总数。3.4.1.2体重及食物利用率记录出生时及生后4、7、14、21、30、60d幼鼠的体重，计算断乳后幼鼠的食物利用率。3.4.1.3生理发育指标记录耳廓分离、门齿萌出、开眼、长毛时间、阴道开放、睾丸下降时间。3.4.1.4神经反射指标平面翻正、前肢抓力、悬崖回避、嗅觉定位、听觉警戒、负趋地性、回旋运动、视觉发育、空中翻正、游泳发育。3.4.2试验原则3.4.2.1给受试物的时间可根据具体情况选择在母鼠孕期或哺乳期至成年期。3.4.2.2在神经反射指标中应选择一组(5个以上)的行为学试验方法，以保证结果的可靠性。3.4.3结果判定在胎仔情况、体重及食物利用率、生理发育、神经反射4类指标中有3类以上(含3类)指标为阳性，可认为受试物有促进生长发育的作用。3.5抗疲劳作用3.5.1试验项目负重游泳试验爬杆试验血乳血清尿素氮肝/肌糖原测定3.5.2试验原则运动试验与生化指标检测相结合。在进行游泳或爬杆试验前，动物应进行初筛。除以上生化指标外，还可检测血糖、乳胶氢、血红蛋白以及磷肌等指标。3.5.3结果判定若1项以上(含1项)运动试验和2项以上(含2项)生化指标为阳性，即可以判断该受试物具有抗疲劳作用。3.6减肥作用3.6.1减肥原则3.6.1.1减除体现人多余的脂肪，不单纯以减轻体重为标准。3.6.1.2每日营养素的摄入量应基本保证机体正常生命活动的要。3.6.1.3对机体健康无明显损害。3.6.2试验项目3.6.2.1动物试验体重体内脂肪重量(睾丸及肾周围脂肪垫)3.6.2.2人体试食试验体重，体重指数，腰围，腹围，臀围体内脂肪含量3.6.3试验原则在进行减肥试验时，除以上指标必测外，还应进行机体营养状况检测，运动耐力测试以及与健康有关的其它指标的观察。人体试食试验为必做项目，动物试验与人体试食试验相结合，综合进行评价。3.6.4结果判定在动物试验中，体重及体内脂肪垫2个指标均阳性，并且对机体健康无明显损害，即可初步判定该受试物具有减肥作用。在人体试食试验中，体内脂肪量显著减少，且对机体健康无明显损害，可判定该受试物具有减肥作用。3.7耐缺氧作用3.7.1试验项目小鼠常压耐缺氧实验3.7.2结果判定耐缺氧实验阳性，说明该受试物具有耐缺氧作用。3.8抗辐射作用3.8.1试验项目3.8.1.1亚急性试验30天存活率或平均存活时间白细胞总数3.8.1.2亚慢性或慢性试验小鼠睾丸染色体畸变试验小鼠骨髓细胞微核试验3.8.2试验原则较高剂量一次辐射，选择亚急性试验；小剂量多次辐射，选择亚慢性或慢性试验。3.8.3结果判定亚急性试验项目中2项结果为阳性，则可判定该受试物对较高剂量一次辐射有拮抗作用。亚慢性或慢性试验中2项结果为阳性，则可判定该受试物对小剂量多次辐射有拮抗作用。3.9抗突变作用3.9.1试验项目Ames试验或V79细胞基因突变试验小鼠骨髓细胞微核试验小鼠睾丸染色体畸变试验3.9.2试验原则Ames试验与V79细胞基因突变试验任选一项，采用体内与体外试验相结合的原则。3.9.3结果判定抗突变三项试验中有两项为阳性时，则可判定该受试物具有抗突变作用。3.10抑制肿瘤作用3.10.1试验项目动物诱发性肿瘤试验动物移植性肿瘤试验免疫功能试验NK细胞活性测定单核巨噬细胞功能测定3.10.2试验原则动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项中任选一项，同时必做2项免疫功能试验3.10.3结果判定动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项试验中有一项为阳性，并且对免疫功能无抑作用，则可判定该受试物具有抑制肿瘤的作用。3.11调节血脂作用3.11.1试验项目大鼠脂代谢紊乱模型法人体试食试验3.11.2试验原则尽可能动物试验和人体试食试验相结合，综合进行评价。3.11.3结果判定大鼠脂代谢紊乱模型法：结果为阳性时，可初步判定该受试物具有调节血脂作用。人体试食试验阳性，可判定该受试物对人体具有调节血脂作用。3.12改善性功能作用3.12.1试验项目3.12.1.1交配试验大鼠交配试验小鼠交配试验3.12.1.2勃起试验3.12.2试验原则评价改善性功能作用，应主要观察是否增强性交功能及阴茎勃起功能。考虑到影响性功能的因素很多，而睾酮对性功能的维持具有重要意义，必要时可对血清睾酮水平进行测定。3.12.3结果判定交配试验(大、小鼠交配试验任选一项)或勃起试验中有一项试验结果为阳性，即可判定该受试物具有改善性功能的作用。3.13人体试食试验规程4评价食品保健作用时要考虑的因素4.1人的可能摄入量除一般人群的摄入量外，还应考虑特殊的和敏感的人群(如儿童、孕妇及高摄入量人群)。4.2人体资料由于存在著动物与人之间的种属差异、在将动物试验结果外推到人时，应尽可能收集人群服用受试物的效应资料，若体外或体内动物试验未观察到或不易观察到食品的保健效应或观察到不同效应，而有关资料提示对人有保健作用时，在保证安全的前提下，应进行必要的人体试食试验。4.3在将本程序所列试验的阳性结果用于评价食品的保健作用时，应考虑结果的重复性和剂量反应关系，并由此找出其最小有作用剂量。4.4食品保健作用的检测及评价应由卫生部认定的保健食品功能学检验机构承担。附加说明-本程序和检验方法由卫生部卫生监督司提出。本程序和检验方法由卫生部食品卫生监督检验所保健食品功能学评价程序和检验方法起草小组负责起草。本程序和检验方法由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。进行未列入程序范围的保健食品功能学评价时，应由保健食品的研制生产者提出检验及评价方法，经保健食品功能学检验机构验证及卫生部食品卫生监督检验所组织专家评审，报卫生部批准后方可列入本程序。本程序中无明确判定方法的人体试食试验结果，可由负责试验单位组织专家组(至少五人)，按本程序提出的原则要求共同予以评价，并提出判定结果。免疫调节作用检验方法动物试验1实验动物选用小鼠。推荐使用近近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，68周龄，1822g，雄均可，数量为单一性别每组至少10只。2给受试物的时间、剂量分组经口给予受试物1530d，设3个剂量组和1个对照组。3个剂量组中，其中1个剂量应相当于人推荐摄入量的10倍左右。3实验方法3.1ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验可任选下列方法之一3.1.1MTT法3.1.1.1原理当T淋巴细胞受ConA、PHA等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解将MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色的甲(formaZan)结晶而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。3.1.1.2丁器和材料RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2基乙醇(2ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐、异丙醇、MTT、Hanks液、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)200目筛网、24孔培养板，96孔培养板(平底)，手术器械、二氧化碳培养箱、联免疫检测丁、超净工作台3.1.1.3实验步骤完全培养液RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10小牛血清，1谷氨胺(200mmol/L)，青霉素(100U/mL)，链霉素(100ug/L)及5105mol/L的2基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.07.2，即完全培养液。ConA液用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(20)保存。无菌Hanks液用前以3.5的无菌NaHCO3调pH7.27.4。MTT液将5mgMTT溶于1mLpH7.2的PBS中，现配现用。性异丙醇溶液96mL异丙醇中加入4mL1mo1/L的HC1，临用前配制。3.1.1.3.2脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95以上)，调整细胞浓度为2106个/mL。3.1.1.3.3淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加50ulConA液(相当5ug/mL)，另一孔作为对照，置5CO2，37培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50u1/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装36孔作为平行样，用联免疫检测丁，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入1mL比色杯中，在721分光光度计上比色测定，波长570nm。3.1.1.4数据处理及结果判定一般采用方差分析进行数据统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值，即可判定该项试验结果阳性。3.1.2同位素掺入法3.1.2.1原理淋巴细胞在有丝分裂原PHA、ConA等的刺激下，产生增殖反应，DNA和RNA合成明显增加，如在培养液中加入3H胸腺嘧啶核(3HTdR)，则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞和放射强度可反映