蛋白质的性质和功能.ppt

高级生物化学,主讲教师：晏本菊教授2014.09,绪论第一章蛋白质的的结构与功能第二章细胞膜的结构与功能第三章物质代谢与细胞信号转导第三章生物化学实验技术,目录,新世纪的生物学基础研究高级生物化学课程的目的和任务高级生物化学课程的主要内容和安排主要参考书,绪论,新世纪的生物学基础研究,20世纪中期，随着蛋白质空间结构的X-射线解析和DNA双螺旋的发现，开始了一个崭新的生物科学时代。对遗传信息的载体核酸和生命功能的执行者蛋白质及其生命现象表现本质的研究成了生命科学研究的主要内容。经过生命科学工作者半个世纪的努力，生命科学已成为自然科学中最重要的学科。当前生物学基础研究的特征和动向可归结成6个方面。,新世纪的生物学基础研究的特征和动向,1、生命科学的主导力量生物化学与分子生物学、遗传学2、生命科学的研究模式由分解向在分解基础上的整合发展3、生命科学的思维方式整体-器官-细胞-分子整体发展4、生命科学的研究技术由实验科学向定量预测的科学发展，整合应用“组学”等关键技术及其平台是重要支撑条件5、生命科学的交叉研究多领域多学科交叉的新阶段6、生命科学的投入产出基础研究和应用紧密结合,目的和任务,重点讲授蛋白质（酶）生物膜的结构和功能，以及细胞代谢、代谢调节与细胞信号转导的基本知识，全面拓宽和深化基础理论，力争较全面地反映当代生物化学研究热门领域的重大成就和发展趋势，达到打好基础、拓宽视野的目的。通过该课程的学习培养同学创新意识和科学思维能力，为各学科研究提供研究技术及研究思想，进而开拓新的研究领域。,主要参考书,1.文树基、郭蔼光高级生物化学，西北农林科技大学2.王镜岩2002生物化学（第三版），高等教育出版社3.孙大业等，2010细胞信号转导基础篇科学出版社4.瞿礼嘉顾红雅等主译，2004植物生物化学与分子生物学科学出版社5.生命的化学双月刊6.Science7.Nature8.MOLCELLPROTEOMICS9.PROTEOMICS10.Plantcell,内容和课时安排,第一部分基础理论（16学时）绪论第一章蛋白质(酶）的结构与功能第二章细胞膜的结构与功能第三章细胞代谢及细胞信号转导第四章生物化学实验技术原理与应用第二部分生物化学实验技术（40学时）,第一章蛋白质的结构与功能,目的与要求：在学习蛋白质基本结构的基础上，认识蛋白质结构与功能的关系，深入理解蛋白质之所以能体现生命现象在于它具有特殊的分子结构。了解蛋白质结构研究的主要方法。,第一章蛋白质的结构与功能,第一节蛋白质的分子结构第二节蛋白质的分子结构与功能的关系第三节蛋白质天然构象的形成与分子伴侣第四节细胞内蛋白质降解第五节蛋白质与蛋白质的相互作用第六节蛋白质结构与功能研究的新领域,第一节蛋白质的分子结构,一蛋白质一级结构及其研究二蛋白质特定构象形成的原因和驱动力三、蛋白质构象的结构层次及其特征,一、蛋白质一级结构及其研究,（1）肽键的结构（2）活性肽,（1）战略原则,（2）测序步骤,3一级结构研究进展,2一级结构的测定,1肽和肽键,将大化小，逐段分析，片段重叠，确定全序,肽和肽键的形成,COOH,多肽链有两端,N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端,氨基酸的顺序是N端C端的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gly丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酸,肽键结构的特点,0.132nm,0.147nm,0.153nm,0.123nm,C-N0.149nmC=N0.127nm,虽是单键却有双键性质周边六个原子在同一平面上，这个平面称为肽平面在大多数情况下，肽键以反式构型存在,活性肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。类激素如催产素、加压素多肽类抗生素如短杆菌肽其它活性肽如鹅膏蕈（毒素）脑啡肽（中枢神经抑制剂）-天冬氨酸-L-苯丙氨酸甲酯(甜味剂）现代高分子材料学及药物设计研究的新领域：人工合成活性肽,插入氨基酸可将生物多肽活性提高40倍（双环肽）NatureChemistry,31August2014;doi:10.1038/nchem.2043。,拿破仑之痒？蛙皮素含14个氨基酸的多肽,蛋白质顺序测定基本战略,测序步骤,纯蛋白质,测定多肽链AA组成,N、C末端AA测定,两种以上方法专一性地裂解成两套以上肽段,分别将肽段纯化，测出其AA顺序,片段重叠法拼凑出整条多肽链AA顺序,确定多肽链中二硫键位置,拆分各多肽链，拆开二硫键,二硫键的断裂,FrederickSanger,多肽N、C末端氨基酸的测定,N端Sanger法（二硝基氟苯反应）DNS法（丹磺酰氯反应）Edman法（苯异硫氰酸脂反应）氨肽酶法C端肼解法还原法羧肽酶法,丹磺酰氯法DNS法,多肽链的部分裂解,酶解法：如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶化学法：如溴化氢法羟胺法(Asn-Gly),苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法）,AA顺序测定,Edman化学降解法DNS-Edman测序法蛋白质顺序仪测序,肽段在多肽链中次序的测定,所得资料：氨基末端残基H羧基末端残基S第一套肽段第二套肽段OUSSEOPSWTOUEOVEVERLRLAAPSHOWTHO,借助重叠肽确定肽段次序：,末端残基HS末端肽段HOWTAPS第一套肽段HOWTOUSEOVERLAPS第二套肽段HOWTOUSEOVERLAPS推断全顺序HOWTOUSEOVERLAPS,对角线电泳示意图,对角线电泳步骤：1.碘乙酰胺封闭-SH2.胃蛋白酶酶切蛋白质（pH2）3.第一向电泳（pH6.5）4.过甲酸氧化处理-S-S-键生成含一对-SO3H丙氨酸的肽5.第二向电泳（pH6.5）6.分离出含二硫键的两条短肽7.测序，与拼接出的多肽链比较，确定二硫键的位置。,a,b,3、蛋白质一级结构研究进展,Edman降解试剂和方法上的改进序列仪的改进和创新质谱法在蛋白质测序中的应用核酸测序和蛋白质测序有机结合在网络上作蛋白质序列分析,通过测定核酸序列推断蛋白质序列,抗体,逆转录,在网络上作蛋白质序列分析,蛋白质数据库Swiss-Prot,TrEMBL,SP-TrEMBL,PIR,GenPept,NRL-3D,PDB,用户定义模式,用户序列,模式检测Pattlnprot,同源性检索BLAST,PSI-BLAST,FASTA,SSEARCH,多序列排比CLUSTALWMULTALIN,氨基酸构成物理化学解剖图复绕检测模式检测PROSITE螺旋转角螺旋,用户数据库,子数据库,二级结构预测GORs,DPM,SIMPA,PREDATOR,PHD,DSC,SOPM,SOPMA,HNN,MLRC,InternetWeb浏览器,二、蛋白质特定构象形成的原因和驱动力,1多肽链折叠的空间限制（1）肽键的双键性质（2）肽单位的平面结构和二面角（3）Ramachandran构象图,Peptidegrup1,二面角,二面角两相邻酰胺平面之间，能以共同的C为定点而旋转，绕C-N键旋转的角度称角，绕C-C键旋转的角度称角。和称作二面角，亦称构象角。,Ramachandran构象图,2蛋白质特定构象形成的驱动力,（1）R-侧链基团间的相互作用（2）肽链与环境水分子的相互作用（3）天然构象形成的过程GC=0和N-H几乎都平行于螺旋轴。3、每个氨基酸残基的N-H与前面第四个氨基酸残基的C=0形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。形成因素：与组成和排列顺序直接相关。,蛋白质螺旋（helix）,蛋白质螺旋的多态性,3.613R(-螺旋),310R-螺旋,4.416R(-螺旋),在天然蛋白质中还发现-螺旋(5.117R),-螺旋(4.314L),胶原螺旋(3.3L)和3.613L等构象,片层（-pleatedsheet）,特征：两条或多条伸展的多肽链（或一条多肽链的若干肽段）侧向集聚，通过相邻肽链主链上的N-H与C=O之间有规则的氢键，形成锯齿状片层结构，即折叠片。类别：平行反平行,0.7nm,回折(reverseturn）,回折：第一个残基羰基上的氧与第四个残基氮原上的氢之间形成氢键，肽键回折1800,常分布在球状蛋白质分子的表面回折：第一个残基的羰基上的氧与第三个残基氮原上的氢之间形成氢键,常出现在反平行片层之间.,Q-环(Q-loop),多肽链中由6-16氨基酸残基(多于回折的残基数,少于复合环的残基数)组成的环状节段称为Q-loop。Q-环以亲水残基为主，几乎总是位于蛋白质分子的表面，与生物活性有关。,超二级结构,在蛋白质分子中，特别是球状蛋白质中，由若干相邻的二级结构单元（即螺旋、折叠片和转角等）彼此相互作用组合在一起，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件单元，称超二级结构。,类型：卷曲的卷曲-螺旋；单元；X单元；-迂回；折叠桶一些已知功能的超二级结构:EF手、锌指（ZineFinger）基元、亮氨酸拉链（leucinezipper）基元螺旋回折螺旋(HTH)、螺旋环螺旋,X,-迂回,回形拓扑结构,超二级结构的类型,-链,EF手图象(钙调蛋白的钙结合位点的螺旋区-泡区-螺旋区结构),Ca2+,Ehelix,Fhelix,E,F,9aa,18aa,12aa,锌指（ZineFinger）基元,Xn-C(H)-X2-4-C(H)-X4-20-C(H)-X2-4-C(H)-Xn,亮氨酸拉链（leucinezipper）基元,（亮氨酸拉链蛋白结合在一个回文的靶DNA序列上的模式图）,亮氨酸拉链蛋白,6aa,回文的靶DNA序列,螺旋回折螺旋(HTH),识别螺旋嵌入DNA主槽，识别特定的碱基序列信息螺旋暴露的氨基酸侧链基团与主槽中暴露的碱基之间形成专一的氢键,螺旋环螺旋,HLH蛋白二聚体中两个螺旋由环连接，螺旋结合特定的DNA序列,螺旋,环,螺旋,HLH同源二聚体,结构域,对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构，这种相对独立的三维实体称结构域。现在,结构域的概念有三种不同而又相互联系的涵义:即独立的结构单位、独立的功能单位和独立的折叠单位。,类型：-螺旋域；-折叠域；+域；/域；无规则卷曲+-回折域；无规则卷曲+-螺旋结构域,结构域运动：结构域本身都是紧密装配的，结构域之间通过松散的肽键形成牢固而又柔韧的连接，为域间较大幅度的相对运动提供了可能，这种结构调整与其整体功能的行使密切相关。,结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。结构域一般由100200个氨基酸残基组成，但大小范围可达40400个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性,结构域是1970年Edelman提出的，它是指在较大的球状蛋白质分子中，多肽链往往形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象就是结构域。,对那些较小的蛋白质分子来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说是单结构域的。一般来说，大的蛋白质分子可以由2个或更多个结构域组成。,结构域有时也称功能域，功能域是指有功能的部分功能域可以是一个结构域，也可以是两个或两个以上的结构域组成。,从动力学的角度耒看，一条长的多肽链先折叠成几个相对独立的区域，再缔合成三级结构要比直接折叠成三级结构更合理。,从功能的角度耒看，酶蛋白的活性中心往往位于结构域之间，因为连接各个结构域的常常是一条松散的肽链，使结构域在空间上摆动比较自由，容易形成适合底物结合的空间。,卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域,-螺旋,-转角,-折叠,二硫键,结构域1,结构域2,植物同源结构域(planthomeodomain,PHD结构域),植物同源结构域(planthomeodomain,PHD结构域)，是真核生物中一种进化保守的锌指结构域多种调控基因转录、细胞周期、凋亡的蛋白质含有PHD结构域研究表明，PHD结构域涉及多种功能，包括蛋白质相互作用，特别是同核小体组蛋白的作用目前认为，各种组蛋白修饰(包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等)的模式和组合，调节染色质状态和基因转录活性，并提出了组蛋白密码理论PHD指结构域能特异性识别组蛋白的甲基化(修饰)密码，可能是组蛋白密码的一种重要解读器需进一步学习的问题：结构域的起源，结构域的进化，结构域预测等？,蚯蚓血红蛋白中四个-螺旋组成的结构域,免疫球蛋白VL-折叠结构域,乳酸脱氢酶结构域1,丙酮酸激酶结构域4,3-P-甘油醛脱氢酶结构域2,木瓜蛋白酶结构域1,木瓜蛋白酶结构域2,无规则卷曲+-螺旋结构域,无规则卷曲+-回折结构域,/结构域,+结构域,平行-折叠不同的排布方式呈现不同的构象,氢键在片层内键的末端处张力相等,氢键在圆筒末端处键的张力相等,伸展的矩形片层,伸展的交错片层,马鞍形扭曲片层,-圆筒,马鞍形结构域,-圆筒结构域,球状蛋白三级结构,球状蛋白三维结构的特征：具有明显的而丰富的的折叠层次；装配紧密的球状或椭圆状；具有疏水的内核和亲水的表面；分子表面有一低介电区域空穴。球状蛋白质的分类：全-结构（反平行-螺旋）蛋白质/-结构（平行或混合型折叠股）蛋白质全结构（反平行折叠股）蛋白质富含金属或二硫键（小的不规则）蛋白质：胰岛素,肌红蛋白三级结构示意图,核糖核酸酶三级结构示意图,血红蛋白的四级结构,烟草花椰病毒自我组装成四级结构,第三节蛋白质天然构象的形成与分子伴侣,1、中心法则研究中一个没有完全解决的重大问题,2、蛋白质天然构象的形成(1)蛋白质折叠密码的复杂性(2)蛋白质折叠的途径(新生肽链折叠假说）(3)折叠所需的蛋白质因子：分子伴侣类泛素化修饰（Neddylation）(4)蛋白质的自剪接(蛋白质的内含子和外显子）,蛋白质的错误折叠可以形成淀粉样沉积进而导致一些疾病的产生,分子伴侣,分子伴侣的概念分子伴侣的分类小分子伴侣与蛋白质复性人工分子伴侣与蛋白质复性,“小分子伴侣”是指GroEL顶区域氨基酸残基191-345的片段,其N端融合了由17个氨基酸组成的组氨酸标签,人工分子伴侣主要模拟天然分子伴侣GroES/GroEL的功能,小分子去污剂能与变性蛋白结合形成复合物,掩蔽其暴露的疏水基,从而阻止蛋白质的凝聚,分子伴侣的概念,Lasky小组于1978年首先提出分子伴侣（mulecularchaperone）的概念，这是一类可以介导蛋白质正确折叠与装配，但其本身并不构成被介导的蛋白质组成部分的一类蛋白因子，在原核生物和真核生物中广泛存在。,分子伴侣的功能：a新生多肽链从核糖体上出现时,其中的疏水性片段很容易与其他的疏水性片段聚集,使得蛋白质不容易形成其所需要的正确构象.分子伴侣可稳定未折叠或部分折叠的多肽，并防止不适当的多肽链内或链间相互作用；b.可与天然构象的蛋白质相互作用以促使寡聚肽蛋白质发生结构重排；c.能识别并调节胞内多肽的折叠，因此还具有介导线粒体蛋白质跨膜转运、调节信息传导通路和转录、复制，以及微管形成与修复等功能。,蛋白质和新生肽的折叠模型,新生肽链,未折叠肽链,复合物,中介,降解产物,正常功能的蛋白质,Aggregates,伴侣分子帮助目标分子进行折叠示意图1，2：伴侣分子(2)与目标分子(1)非特异性结合；3，4：伴侣分子的无序结构部分有序化(3)，而目标分子(4)形成不稳定结构，重新折叠后与伴侣分子分离,分子伴侣的分类,普通意义上的分子伴侣（在进化上非常保守的热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)的3个家族：Hsp60，Hsp70，Hsp90）具有酶活力的分子伴侣,又称折叠酶（蛋白质二硫键异构酶（PDI)，肽基脯氨酰顺式异构酶）分子内伴侣(intramolecularchaperone,IMC),对蛋白质折叠有帮助的前导肽称为分子内分子伴侣,分子伴侣系统,1.Hsp70系统Hsp70,Hsp40,GrpE(核苷酸交换因子），它们利用ATP水解供能来改变底物蛋白质结构，交换因子将ADP重新生成ATP.伴侣蛋白系统由一个很大的寡聚复合体组成（类似一个园柱体），这种寡聚复合体的结构可使未折叠的蛋白质插入其中这种受保护的环境会诱导蛋白质折叠类Hsp60（GroEL)Hsp10(GroES)：两个反向的七聚体环，加一七聚体拱顶类TRiC:只存在于真核生物的细胞质中：形成两个十聚体环.Hsp90与Hsp70协同作用：参与信号转导途径中的特殊类型的蛋白质，尤其是类固醇激素受体和信号传导途径中的激酶主要功能是保持其靶蛋白处于合适的构象，直到与信号通路中其他的成员相互作用。,热激蛋白(heatshockproteins,Hsp),热激蛋白是因为在温度升高时，它们会大量产生，以尽量减少热变性对蛋白质的损害很多热激蛋白都是分子伴侣1974年Tissierres等发现Drosophila热激蛋白，随后在许多原核生物和包括植物在内的大批真核生物内都发现了Hsp。是多基因族编码的产物，其表达包括组成型的和胁迫诱导的，除热休克外，寒冷、盐、重金属、醇、亚砷酸、葡萄糖饥饿、氨基酸类似物等，均可诱导Hsp基因表达。Hsp基因表达有组织专一性，与生物对热冲击的耐受性有关，在不同生物中诱导Hsp基因表达的分子机制也有许多相似之处真核生物(在一定程度上包括原核）主要Hsp呈现高度同源性，表明其功能对生存是基本的、必要的。,Hsp70,Hsp70广泛分布于各种生物和真核细胞内各区域，是多基因编码的产物有一个高度保守的N端ATPase功能域，C端结构域为靶蛋白结合区,Hsp（GroEL)Hsp(GroES),HspHsp,Hsp70分子伴侣功能,新生肽链,变性蛋白质,ATP,ADP,蛋白质二硫键异构酶家族的结构与功能,PDI家族的成员：哺乳动物PDI家族成员到目前为止已经发现了19个（其中PDI,ERp57,ERp44是其中的代表）。PDI家族的结构特征：PDI的催化特性PDI家族在蛋白质折叠和分泌过程中的作用,类泛素化修饰（Neddylation）,依赖泛素及类泛素蛋白的翻译后修饰已经被证实参与几乎所有细胞内的调控过程，如细胞周期、信号传导、免疫识别、细胞凋亡、细胞增殖与分化、蛋白质转运、器官起源、炎症、抗原呈递、内质网调控、DNA修复以及应激反应等等,NEDD8,NEDD8是由81个氨基酸编码的蛋白质，它和泛素具有60%的一致性和80%的相似性，在酵母和植物中其同源基因被称为Rub1，它可以产生并且连接到少量的细胞内蛋白质上NEDD8和Rub1的晶体结构已经被解析出来，总体结构与泛素相似，主要的区别仅在两者表面区域具有不同的静电势能面，所以与其他发现的类泛素分子相比，NEDD8的结构与泛素是最为接近的，大多数真核生物(植物、动物、真菌)中NEDD8高度保守，因此NEDD8在真核细胞中具有十分重要的功能，NEDD8特异性地与底物蛋白相结合的修饰过程被称为Neddylation。Neddylation异常可以导致人类的神经退行性疾病和癌症。,Neddylation的生物学功能,虽然Neddylation修饰与泛素化过程相似，但是与泛素化不同,Neddylation修饰的蛋白质不像泛素化的蛋白质那样能被蛋白质酶体降解影响底物蛋白的稳定性，而是仅作为一种活化信号，其功能表现在：调节蛋白质之间的相互作用调节转录因子活性,（A）PDI结构域组成图示.活性位点如图；（B）酵母PDI三维结构示意图.球形代表活性位点的半胱氨酸.,A,B,DHVSAV,HumanYeast,YAPWCGHCKALAFAPWCGHCKALA,YAPWCGHCKALAYAPWCGHCKALA,Activesite1,Activesite2,SHS,Erolp,S,S,Erolp,SH,SH,FAD,H2O2O2,PDI,PDI,SH,SH,S,S,S,S,S,S,HS,HS,HS,HS,Newly,synthesized,protein,Native,PDI,S,SH,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,PDI,Degradation,Non-native,Aggregation,内质网中蛋白质氧化折叠反应的机制示意图,PDI可以催化新生肽链中二硫键的形成、异构或还原，但它只是传递氧化当量,ERO是一个黄素蛋白,PDI家族在蛋白质折叠和分泌过程中的作用,PDI:可催化较广泛的底物的二硫键的形成ERp57:可催化凝集素二硫键的形成及其折叠，清除错误折叠的蛋白质，抵抗内质网胁迫诱导的细胞凋亡。ERp44:ERp44对蛋白成熟过程中的新生肽和过表达的Ero1通过巯基介导的定位作用使之停留在早期的分泌通路中。,生物超分子体系,为了胜任在生物体内的功能，许多蛋白质要进一步组装成比四级结构更为复杂的超分子体系。除了蛋白质外，一些生物超分子体系还包含有其它生物大分子，如核酸、糖类和脂类，甚至有某些金属离子和其他小分子物质。.离散型胞液中糖酵解酶系与细胞骨架缔合.膜结合型线粒体内膜上的呼吸链.紧密的非共价组合型转录起始体系,蛋白酶体,DNA复制体系,毛发横切面和毛发-角蛋白的结构,-螺旋,原纤维,微纤维,微纤维,大纤维,细胞,角质层（鳞状细胞）,纤维蛋白质:丝心蛋白(fibroin)结构,A.堆积的-折叠片的三维结构,B.交替层中的Ala(或Ser)残基和Gly残基侧链(H原子)的连锁,胶原纤维(collagenfibril)中原胶原蛋白分子的排列,第二节蛋白质的分子结构与功能的关系,一肌红蛋白（Myoglobin）和血红蛋白（Hemoglobin）的结构与功能二免疫球蛋白的结构与功能三朊病毒的结构和功能四.转录因子的结构与功能,一、肌红蛋白（Myoglobin）和血红蛋白（Hemoglobin）的结构与功能,1Mb和Hb的结构特点2Mb和Hb的氧合曲线和Hill图3Hb的变构效应与O2的运输4异常血红蛋白与分子病,3Hb的变构效应与O2的运输,（1）Hb的变构效应氧合中血红素铁原子的变化亚基三级结构的变化四级结构的变化（2）BPG对血红蛋白氧亲和力的影响（3）H+浓度、CO2的分压对Hb氧亲和力的影响(4)结语,BPG降低Hb对氧的亲和力,H+、和CO2促进氧的释放（Bohr效应,4异常血红蛋白与分子病,(1)分子表面发生的变异(镰刀状红细胞贫血病)(2)血红蛋白结合部位发生变异(3)三级结构发生突变(4)四级结构发生突变,血红蛋白的-亚基和肌红蛋白分子,血红蛋白的结构模型,Mb的氧合曲线和Hill图,则,令氧饱和度=Y=,（1）,将其带入（1）式，得：,Y对Po2作图得氧合曲线,求得：,Mb的Hill图,将（2）作变换：,得Hill曲线,Hb的氧合曲线和Hill图,Y对Po2作图得氧合曲线,对,作图,得Hill曲线,与Mb同理推得：,Mb和Hb的氧合曲线比较,血红蛋白和肌红蛋白的Hill曲线,肌红蛋白的Hill曲线,斜率=1,-logK,logPO2,log,血红蛋白的Hill曲线,斜率=2.8,Hb的输氧功能,Mb的储氧功能,血红蛋白输氧功能和构象变化,(R)relaxedstate,(T)tensestate,血红蛋白,O2,肌红蛋白,WhenenvironmentalO2increases,Hbbindsoxygenefficiently,WhenenvironmentalO2decreases,HbreleasesoxygentoMb,Anyonesubunitreceivesanoxygenmoleculewillincreasetheoxygen-bindingaffinityoftheothers,JuangRH(2004)BCbasics,动脉,协同效应（cooperativeeffect）:一个效应物分子结合于蛋白质的变构中心后对第二个效应物分子结合的影响称为协同效应。,氧合过程中血红素铁原子的变化,氧合过程中铁原子位移引发的构象改变,O2,F8Histidine,空间排斥,Feme,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动,脱氧血红蛋白亚基间的交联键,氧合血红蛋白结构模型,血红蛋白四级结构的滑动变化,血红蛋白四级结构的旋转变化,2,3-二磷酸甘油酸（BPG）在脱氧Hb中的结合位点,BPG对Hb的变构效应物功能,波尔效应,Hb-O2+H+CO2,H+Hb+O2CO2,在肌肉中pH7.2(Hb脱氧结合CO2),在肺部pH7.6(Hb结合氧释放CO2),pH对Hb与氧亲和力的影响,结语,氧的S形曲线结合，波尔效应以及BPG效应物的调节使得血红蛋白的输氧能力达到最高效应。同时由于能在较窄的氧分压范围内完成输氧功能，因此使肌体的氧水平不致有很大的起伏。此外血红蛋白使肌体内的pH也维持在一个较稳定的水平。血红蛋白的别构效应充分地反映了它的生物学适应性、结构与功能的高度统一性。,人血红蛋白中氨基酸的置换情况举例,不正常的-链不正常的-链残基不正常Hb命名在HbA中的不正常Hb残基不正常Hb命名在HbA中的不正常Hb顺序号残基（正常）中的残基顺序号残基（正常）中的残基16ILysAsp6CGluLys30G檀香山6SGluValG新加坡GluGly7G圣约翰GluGlyG香港26EGluLys57诺福克GlyAsp63M萨斯卡通HisTyr58波士顿HisTyrM爱牟利HisTyr68G菲利普AspLys63苏黎克HisArgG布里斯托尔AspLys67M密尔瓦斯LysGlu116O印尼GluLys121D劳庶普GluGlu,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,-链N端氨基酸排列顺序12345678Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,正常红细胞,镰刀形红细胞,正常血红蛋白与异常血红蛋白序列比较,镰刀型红细胞贫血病的分子机理,脱氧HbS聚集成纤维状结构,6条脱氧HbS纤维状缠绕成长管状结构,B,A,C,Hb的氨基酸取代导致血红素结合部位发生变异,E7,F8,E11,Hb每个亚基都有一个结合血红素的疏水性裂隙,，除结合血红素的F8His和E7His外，其余与血红素接触的19个残基有17个是疏水残基。上述残基发生取代影响到血红素的结合及Hb的稳定性，在红细胞中形成沉淀。,-链上氨基酸残基缺失导致三级结构改变,如果Hb肽链中螺旋段的残基被Pro取代，或螺旋段及非螺旋拐弯处缺失一个或多个残基，均可破坏-螺旋和肽链的构象，导致Hb稳定性下降，丧失O2结合能力。,四级结构突变的Hb,血红蛋白多肽链接触区氨基酸残基发生置换，如发生在22接触区，则造成变构效应的丧失，可影响整个分子对氧的亲和力以及血红素之间的相互作用，出现异常的氧亲和力。由于与氧的亲和力增高，对于在组织中的氧释放不利，常代偿性的出现红细胞增多症。,二、免疫球蛋白的结构与功能,1抗原(antigen)抗体(antibody)的一般概念,2免疫球蛋白（immuneglobin）的分类,3免疫球蛋白结构（1）一级结构（2）空间结构4免疫球蛋白的主要功能5.多克隆抗体和单克隆抗体,4免疫球蛋白的主要功能,(1)结合抗原(2)激活补体(3)调理作用,抗原和抗体,当外源物性物质，如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、颗粒（细菌、细胞、病毒）进入人或动物体内时，机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白（immuneglobin），并与之结合，以消除异物的毒害。此反应称为免疫反应，此异物便是抗原，此球蛋白便是抗体。,人免疫球蛋白的分类,免疫球蛋白IgG的一级结构,IgG结构,IgM的一级结构,IgG的空间结构,IgG与抗原形成的交联晶格,溶菌酶与抗体Fab片段结合模型,H链,L链,溶菌酶,Glu,四个Fab单位与神经氨糖酸苷酶四聚体结合模型,神经氨糖酸苷酶,H链,L链,抗原激活补体的功能,存在于正常血清或体液中，具有酶活性的一组球蛋白，要经连锁反应依次活化后才表现生物活性，不因抗原刺激而增加，在免疫病理中起重要作用属天然免疫力，含量较稳定。,抗原细胞,抗体的调理功能,抗原细胞,单克隆抗体和多克隆抗体,1、单克隆抗体（polyclonalantibodies）2、多克隆抗体（monoclonalantibodies）,是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体。把单克隆抗体与抗癌药物或毒素结合起来，就成为威力强大的抗体“生物导弹”,由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。,单克隆技术过程,单克隆抗体由可以制造这种抗体的免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞产生的，这种融合细胞即具有瘤细胞不断分裂的能力，又具有免疫细胞能产生抗体的能力。融合后的杂交细胞(杂种瘤)可以产生大量相同的抗体。,三、朊病毒的结构和功能,1.朊病毒（prion，PrP）的概念和结构2.PrPC的可能生理功能3.PrPSc与Prion病4朊病毒的研究中有待解决的问题,朊病毒,朊病毒(Prion)或朊病毒蛋白（prionprotein,prp)是一类高度保守的糖蛋白，其广泛表达于脊椎动物，且与神经系统功能的维持、淋巴细胞信号转导、核酸代谢等有关；当其发生构象改变后可变成致病性朊病毒(PrPSc)。,朊病毒又称蛋白质侵染因子。朊病毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。羊瘙痒病、疯牛病、人类海绵状脑病（Kuru病、CJD病、GSS病）都是感染朊病毒后发生的,朊病毒的化学结构,PrPC以螺旋结构为主,含有一个相对不灵活的球形结构域(128227残基)和一个高度灵活的主要为无规则结构的端结构域；2989残基区域含有能结合铜原子的由32个氨基酸残基组成的4次重复的八肽序列，每个八肽中均含有一个组氨酸，该区域也是高度灵活的。90140残基是一相对灵活的区域，该区域含有一个PrPC进行正常分解代谢的裂解位点，且其在不同种属蛋白质序列之间是十分保守和独特的，因此，该区域可能是蛋白质行使正常功能活性的一个至关重要的区域。,蛋白质折叠过程能量地形面示意图,神经退行性疾病组织内的聚集物,淀粉样纤维的分子模型,淀粉样纤维形成过程的分子模型,PrPC的结构,rSHaPrP(902231)的NMR图谱,鼠朊病毒蛋白PrPC(23230)的溶液三维结构,朊病毒的三维结构,PrPsc分子在机体内的复制、扩散和侵袭途径,朊病毒的可能生理功能,（1）PrPC在神经系统中的可能作用可能参与神经系统功能的维持可能通过抗氧化途径而保护神经系统细胞免受氧化损伤（2）PrPC可能参与淋巴细胞的信号转导（3）PrPC可能参与核酸代谢,PrPSc与Prion病,目前普遍认为Prion病发生的基本事件是:以螺旋为主的对蛋白酶敏感的不具有感染能力的PrPC转变成以片层为主的对蛋白酶抵抗的具有感染能力的不溶性PrPSc。少量PrPSc与细胞PrPC结合后,以PrPSc为模板，使PrPC发生明显构象改变而转变为PrPSc，从而达到PrPSc传染扩增的目的,最后使PrPC全部转变成不溶性的PrPSc，脑组织形成淀粉样斑块直至死亡。推测PrPC转变成PrPSc后造成PrPC缺乏，这种缺乏一方面使得神经细胞SOD样活性下降，从而对超氧化物等所造成的氧化损伤的敏感性增加，另一方面也使神经细胞对高谷氨酸和高铜毒性的敏感性增加，综合导致神经细胞死亡变性。,PrPSc致病特点,PrPSc所导致的Prion病既是传染病,也是遗传病,还可以是个案病例。PrPSc作为致病因子,既可在同一种属间进行传播，也可跨种属屏障传播，在人的Prion病例中，约有10%具有家族性，且与PrP基因突变连锁,故该病具有遗传性，偶见一些病例为单发的个案病例。PrPSc的扩增和致病与分子生物学中心法则和蛋白质折叠的Anfinsen原理相抵触。迄今，人类已发现的传染病病原体都含有核酸，它们的扩增繁殖都遵循遗传信息流的中心法则。而PrPSc不含核酸，它是通过与PrPc相互作用，诱导其变构而转变成PrPSc，从而实现自身增殖,其增殖过程不涉及核酸复制，可见这与中心法则明显相左。经典的Anfinsen原理认为蛋白质的氨基酸序列唯一地决定其高级结构，而PrPSc与PrPc在氨基酸序列上完全一致，但二者构象不同。在病变的脑组织中不出现伴随的免疫卫士白细胞，也就是说免疫系统不能识别具有相同序列但构象不同的两种朊病毒。,朊病毒研究中待解决的问题,关于PrPC缺失是否会影响GABA型抑制电流和LTP等电生理参数尚有争议，因为在生理温度下,这些参数有改变，而在室温下则无变化；虽已证明PrPC可结合铜原子，但PrPSc能否结合铜原子尚无定论；虽已初步得知PrPC可能参与淋巴细胞信号转导和核酸代谢，但具体机制尚待阐明；关于PrPSc增殖机制虽有一种合理的假设，但详细过程尚待深入探讨；疯牛病可跨种属屏障传播，表明决定哺乳类间种属屏障的分子基础还需深入研究；免疫系统为何不能识别具有相同序列但构象不同的两种朊病毒还是一个不解之谜；PrPSc的扩增和致病与中心法则和Anfinsen原理相左的深层意义还有待阐明等等。,朊病毒致病过程中的构象变化示意图,PrPC(-螺旋),PrPSc(-折叠),解释PrPsc自我复制现象的两种假说,朊病毒增殖机制,天然的PrPC分子(圆形)与单体型前体PrPSc构象同工型保持一种平衡状态,单体型前体相互作用直至形成稳定的传染性核心,核心结构加速增长,分裂成具侵染能力的小颗粒单元。,第四节蛋白质结构与功能研究的新领域,1结构生物学X-射线晶体衍射技术的改进多维核磁共振波谱解析电子显微镜二维晶体三维重构,2蛋白质组学研究3生物信息学的介入4.无序蛋白,无序蛋白是真核生物蛋白质中的一大类，它们通常具有序列重复性高、高亲水性与带电性及编码基因序列简单的结构特征，同时还具有易结合、空间优越性和高度协调性的生物学优势。尽管不具有高级结构，但无序蛋白是有功能的，其功能的最主要体现者是伴侣分子。,结构生物学,结构生物学是以生命物质的精确空间结构及其运动为基础来阐明生命活动规律与生命现象本质的科学，研究的核心内容是生物大分子及其复合物和组装体的完整、精确的三维结构、运动和相互作用，以及它们与正常生物学功能和异常的生命现象之间的关系。,X-射线衍射晶体结构分析示意图,蛋白质组研究简介,相应于基因组学，1994年Wilkin和Williams首次提出蛋白质组（proteome）概念。所谓蛋白质组，即指某一物种、个体、器官、组织、细胞乃至体液在精确控制其环境条件之下,特定时刻的全部蛋白质表达图谱。与以往的经典蛋白质化学研究相比，蛋白质组的研究对象不再是单一或少数蛋白质，而是着眼于全面性和整体性，需要研究体系内所有蛋白质组分的物理、化学、生物学性质与功能，最终获得每个蛋白质组分的性质功能、表达变化及翻译后加工的大规模信息。蛋白质组研究主要集中在原核生物及一些基因序列全部或大部分已知的真核生物上。对人类蛋白质组的研究目前多围绕于特异的组织、细胞和疾病上。通过蛋白质组的研究，比较研究体系内不同状态的蛋白质表达图谱，定量分析各蛋白质的变化，从而可以对体系内复杂代谢、调控等生物功能进行动态监测。,OverlayCy2,Cy3,Cy5,Cy2(Jing411-andSunstate-),Cy5(Sunstate-),Cy3(Jing411-),Imagesfrom2-DDIGEanalysis,pH4pH7,NucleosidediphosphatekinaseI,Monomericalpha-amylaseinhibitor,Triticinprecursor,PutativednaK-typemolecularchaperoneprecursor,Proteinsample,Imageanalysis,Proteiningel,Proteinonmembrane,Proteininsolution,2-DPAGE,Excision,Blotting,Elution,Partialdegradation,Peptidemixture,Massofprotein,N-terminalsequence,MS,Edmandegradation,Peptidemassfingerprint,PeptidesequenceMS/MSdata,Databasesearching,Novelorpreviouslystudiedprotein,Characterizationofpost-translocationmodifications,蛋白质组的分析流程,生物信息学,生物信息学把基因组序列信息分析作为源头,在获得了蛋白质编码区的信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测，同时用高性能电脑对已知蛋白质序列和三维结构进行收集、整理、存储、发布和分析，预测其功能，依据特定蛋白质的功能进行必要的药物设计。因此在基因组研究时代，基因组信息学、蛋白质的结构模拟及功能研究，以及药物设计必然有机地连接在一起，它们是生物信息学的三个重要组成部分。,第五节细胞内蛋白质的降解,一、蛋白质酶的种类和专一性肽酶（Peptidase）蛋白酶(Proteinase)二、细胞内蛋白质降解的特性三、蛋白质降解的生物学意义四、细胞组织蛋白的胞内降解途径溶酶体(lysosome)途径泛肽（ubiguitin）途径,蛋白酶的种类和专一性,编号名称作用特征实例,3、4、2、1,3、4、2、2,丝氨酸蛋白酶类,(serinepritelnase),活性中心含Ser,3、4、2、3,3、4、2、4,硫醇蛋白酶类,(Thiolpritelnase),活性中心含Cys,羧基（酸性）蛋白酶类,carboxyl(asid)pritelnase,活性中心含Asp,最适pH在5以下,金属蛋白酶类,(metallopritelnase),活性中心含有Zn2+、Mg2+等金属,胰凝乳蛋白酶胰蛋白酶凝血酶,木瓜蛋白酶无花果蛋白酶菠萝酶,胃蛋白酶凝乳酶,枯草杆菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶,肽酶的种类和专一性,二羧肽水解酶,（Phe.Tyr.Trp）,（Arg.Lys）,细胞内蛋白质降解的特性,.需要能量.快速蛋白水解装置一旦遇到合适目标，立即将其彻底消化.蛋白酶的专一性较低.细胞内蛋白水解是高度选择的,蛋白质降解的生物学意义,维持细胞内氨基酸代谢库的动态平衡参与细胞程序性死亡和储藏蛋白的动员蛋白质前体分子的水解裂解加工清除反常蛋白质免其累积控制细胞内关键蛋白的浓度，调节代谢或控制发育进程参与细胞防御机制,溶酶体系统,富含有在酸性条件下起作用的酶，能把经内吞摄入细胞的外源蛋白或经受体介导胞饮进入的激素和脂蛋白、铁传递蛋白、受体等长寿命蛋白迅速降解成肽和氨基酸溶酶体中至少含有多种水解酶，包括多种组织蛋白酶（组织蛋白酶B、L、H、M、N、S、T、D、E）,蛋白质降解泛肽途径,1.泛肽2.与蛋白质泛肽化有关的酶类3.去泛肽化酶（DUBs)消除错误的泛肽化，具有裂解脂键，硫脂键以及泛肽C-端与Lys侧链-NH2形成的异肽键的活力，使泛肽再生。4.26S蛋白酶体：20S蛋白酶体，19S调节复合物5、蛋白质降解的泛肽途径模型,泛肽:给选择降解的蛋白质加上标记,Hershko,A.等1978年从网织红细胞依赖ATP的蛋白质水解系统中分离出一种热稳定因子，由76个氨基酸组成，后来发现它广泛存在于各类真核细胞因而名民为泛肽（ubiquitin)。被选定的蛋白质先加以标记，在一个需ATP的反应中有泛肽激活酶（E1)、泛肽载体蛋白（E2）和泛肽蛋白连接酶（E3）的共同作用下形成多泛肽化蛋白。这样，泛肽连接的蛋白质，即在ATP依赖的反应过程中被降解。,泛肽三维结构,29、48、63位的Lys残基参与多泛肽链的形成,泛肽化有关的酶类,E1:泛肽活化酶E2:泛肽载体蛋白E3:泛肽连接酶E4:泛肽链延伸因子UBP:泛肽结合蛋白,20S、26S蛋白酶体,20S蛋白酶体由14个亚基和14个亚基组成；中央两个亚基组成的环含有个蛋白水解活性，外侧环各结合一个19S调节复合物,19S调节复合物功能,1820种不同的亚基组成，其中种具有ATPase活性识别并结合多泛肽化的靶蛋白激活20S蛋白酶体的蛋白酶活性参与底物蛋白的伸展切除(Ub)n链并将其降解成Ub单体,蛋白质降解的泛肽途径,E1-SH,E1-SH,E2-SH,E2-SH,ATPAMP+PPi,E3,多泛肽化蛋白,ATP,26S蛋白酶体,20S蛋白酶体,ATP,19S调节亚基,去折叠,水解,E1：泛肽激活酶E2：泛肽载体蛋白E3：泛肽-蛋白质连接酶,（ubiquitin）,转录因子的结构与功能,转录因子的定义转录因子的结构转录因子的分类转录因子的功能,转录因子,定义：转录因子(transcriptionfactor)是一群能与基因5端上有特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。结合位点：转录因子的结合位点（transcriptionfactorbindingsite，TFBS）是转录因子调节基因表达时，与基因模板链结合的区域。按照常识，转录因子（transcriptionfactor，TF）的结合位点一般应该分布在基因的前端，但是，新的研究发现，人21和22号染色体上，只有22%的转录因子结合位点分布在蛋白编码基因的5端。,转录因子的分类,1、RNA聚合酶的亚基RNA聚合酶的亚基，它们是转录必须的，但并不对某一启动子有特异性。2、与RNA聚合酶结合形成起始复合物的蛋白因子某些转录因子能与RNA聚合酶结合形成起始复合物，但不组成游离聚合酶的成分。3、仅与其靶启动子中的特异顺序结合的蛋白因子,转录因子的特殊结构,典型的转录因子含有DNA结合区(DN