肿瘤分子生物学 特选材料

肿瘤（tumor）是一类疾病的总称，它们的基本特征是细胞增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。肿瘤可分为良性肿瘤（benign tumor）和恶性肿瘤（malignant tumor）。良性肿瘤生长缓慢，虽可增长至相当大的体积，但仍保留正常细胞的某些特性，通常在瘤体外有完整的包膜，手术切除后患者预后良好。绝大多数良性肿瘤基本上是无害的，不引起或很少引起宿主损伤。恶性肿瘤统称为癌症（cancer），它不同于良性肿瘤的最重要的特性是能侵袭周围组织，疾病晚期癌细胞发生远端转移，破坏受侵袭的脏器，最终使机体衰亡，但如能在侵袭转移前切除癌瘤，一般预后明显改善。2、癌细胞的恶性生物学特征（1） 失去了对中止细胞增殖信号和细胞分化信号的反应，并可传出自主的细胞生长、增殖信号。（2） 逃避了细胞凋亡和衰老，是细胞永生。当正常细胞受到严重损伤和营养缺乏时，就发生凋亡并自动解体；而癌细胞并不一定会发生凋亡。体外培养的正常细胞，即使没有受到损伤，约分裂50后也会自动停止分裂，最终细胞死亡（细胞衰老）；而癌细胞能无限制地增殖，获得了永生化。这可能与调控细胞凋亡基因的缺陷和端粒酶恢复活性相关。（3） 失去细胞的区域性限制，具有了侵袭和转移能力。例如在体外培养的正常细胞中增殖至彼此接触时，就停止生长和分裂（结出抑制），故细胞呈单层生长，而癌细胞失去了接触抑制，继续分裂而呈多层重叠生长；同时癌细胞表面的识别能力和黏着性发生了改变，使癌细胞不能像不同的正常组织细胞那样保持彼此分开，而能侵入临近组织。（4） 自主的血管生成能力，这保证了肿瘤体积增大后和新形成转移肿瘤的血液供应，以维持癌细胞生长和增殖之所需。上述这些癌细胞的恶性特性，使它们能在没有增殖信号的情况下，自主地无限制增殖，当达到一定的体积时就可能侵袭邻近组织，癌细胞还可能脱落进入血液和淋巴液，发生远端转移并扩增，最终导致宿主死亡。3、癌的单克隆起源和异质性除少数例外，癌是原始的、单个癌细胞增殖的后代，即癌为单克隆起源。这一观点已被普遍接受，部分是依据来自X染色体上基因表达的观察。妇女有两条X染色体，在卵裂的后期其中一条X染色体随机失活，如一位基因杂合子的妇女患癌，若是多克隆起源，癌细胞则可能有两种等位基因表达的产物；若是单克隆起源，则癌细胞仅有一种等位基因表达产物，而研究结果证实了癌为单克隆起源。由于与DNA修复和细胞分裂等一系列相关基因的缺陷，使癌细胞基因组和染色体的稳定性下降，于是在肿瘤演进过程中，就可能不断产生新的癌细胞干系，它们彼此间免疫系统和治疗等因子作用下，如不能被全部杀灭，就可能选择了恶性程度更高的癌细胞干系，它们继续重复突变、扩增和选择的过程，给治疗带来困难。二、癌基因癌基因是正常细胞基因即原癌基因（proto-oncogene）的一种转化形式。它编码具有显性转化性质的调节蛋白，即改变了的单拷贝序列能转化整个细胞，而另一正常序列不能阻断这种转化能力。1. 原癌基因的蛋白质产物（1）生长因子growth factor生长因子刺激静止期或G0期细胞进入细胞周期。这一有丝分裂应答需要两个生长因子互补群之间的协同作用。第一互补群是“感受性因子”（competence factors），如PDGF、FGF或表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），它们刺激静止期细胞进入细胞周期的G1期。第二互补群是“进行性因子”（progression factors），如胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1），保证细胞开始DNA合成。所以，某种生长因子的不适宜表达除了导致对细胞分化的阻断之外，还会导致对细胞生长的不断刺激。（2）生长因子受体growth factor receptor一般来说，生长因子能识别与之相应的生长因子受体肿瘤抑制基因的发现从1969年起，Harris等用体细胞杂交的方法研究肿瘤。他们发现，小鼠的恶性肿瘤细胞与正常小鼠细胞杂交后，产生的杂种细胞失去了恶性表型；接种到适当的宿主体内后不再长瘤。正常细胞中存在肿瘤抑制基因，可以抑制肿瘤细胞的恶性表型。1. RB1RB1蛋白是一种磷酸化蛋白，它能与DNA结合；另外，还有一个GGAAGTGA元件，对TP53的作用敏感，受它的调节。RB1蛋白在60%以上已研究过的人类肿瘤中失活， 50%癌症是由于发生了点突变。肿瘤类型除视网膜母细胞瘤外，包括骨肉瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌等。RB1蛋白的功能在于维持基因组的完整性。它很可能是通过其多重生物学活性的效能而抑制肿瘤形成的。2. TP53TP53基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，几乎在所有种类的肿瘤中，在80%以上的肿瘤组织中发现了TP53基因的突变。TP53蛋白是细胞核内的一种序列特异性转录因子。TP53诱导细胞凋亡。这样，TP53防止了携带广泛性DNA损伤的细胞通过克隆性生长而导致肿瘤。1910年，Rous将鸡肉瘤组织的无细胞滤液注射到健康鸡的体内，结果诱发了健康鸡长出肉瘤，从而发现了现在被称为Rous肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）的一种RNA急性致癌病毒。然而，这一发现在肿瘤研究中长期遭到漠视。20世纪60年代开始，病毒与肿瘤的关系日益受到重视；Rous终于在1966年获诺贝尔医学生理学奖，时年85岁。microRNA（miRNA）是一类大小约22个核苷酸的非编码小分子RNA，它们能通过与靶mRNA的3UTR（非编码区）完全互补导致mRNA降解，或不完全互补结合阻断mRNA翻译。以miRNA为基础的RNA干扰（RNAi）技术让科学家们掌握了一种人为控制基因表达的手段，也因此RNAi发现者获得2006年诺奖。许多研究表明利用miRNAs，能靶向治疗癌症，或者作为癌症早期诊断生物靶标。RNAi药物相对于传统的小分子药物以及其他生物类药物（如蛋白类药物、疫苗等）有自己独特的优势7-8：（1）RNAi药物具有高特异性和高效性。siRNA的干扰效应具有高度的序列特异性，任一碱基错配都会导致RNAi效应丧失，因此RNAi药物具有很强的靶向性。理论上RNAi可以抑制各种疾病相关基因的表达，也就是说只要明确了各种疾病的RNAi靶点，RNAi药物可以治疗各种疾病。（2）RNAi药物与其他生物类药物相比，由于分子量小，RNAi药物无免疫原性。（3）RNAi药物设计便利性，RNAi药物设计的唯一要求是合成与药物靶点基因mRNA完全配对的长度大约20个碱基的siRNA分子，这种便利性大大降低了新药的开发成本，同时有利于研究RNAi药物安全性和有效性。1.1 基于肿瘤信号传导途径的 RNAi 治疗药物研究1.2 细胞周期1.3 细胞凋亡1.4 细胞衰老肿瘤信号传导通路是多个因子构成的复杂网络体系， 在肿瘤的发生、 发展过程中起着重要作用， 一些关键基因的变化可以使某条通路处于非常活跃的状态， 也可使通路受阻 应用 RNAi 技术的肿瘤模型研究已经找到了一些肿瘤信号传导通路中的关键基因， 在肿瘤的形成过程中改变较多的通路有 PTK、 MAPK、 PC、 HGF/SF Met、 I3K、Smad、 HIF 等NF-kappa B 是一种重要的转录因子，调控细胞因子、生长因子及细胞粘附分子等的基因表达，与细胞信号转导密切相关。 靶向kappa B P65的RNAi研究 8 显示，kappa B P65 表达的下调引起胰腺癌BxPC-3 和 PANC-1 细胞中 Bcl-2 及 procaspase-3蛋白表达下调，Bax 蛋白表达上调，明显降低细胞活力，增大细胞凋亡率。体内抗肿瘤实验中同样能抑制裸鼠移植模型的肿瘤细胞增殖。在 APC 通路， Wnt 配体结合到受体活化一个叫 Dsh 的中间蛋白， Dsh 通过抑制 GSK 3 的降解使 连环蛋白( catenin) 不被降解， 在结肠癌中通常缺少 Wnt 信号配体或存在 APC 突变体 catenin 首先在胞质中积累， 然后被转移到核仁， 在核仁它与转录辅助因子结合激活许多基因的表达 丝氨酸/苏氨酸激酶、 酪蛋白激酶或 GSK3 导致的磷酸化使 catenin 的表达水平很低 用脂质体介导的 siRNA 来抑制 catenin 的表达， 能抑制直肠癌细胞的增殖21 APC 能影响包括 c Myc 致癌基因在内的许多特殊基因的表达， 在对乳腺癌模型的体内、 外研究中发现用抗 c Myc 的 siRNA 能使肿瘤细胞的增殖受到抑制22 1982年，美国科学家R.A. Weinberg等人从膀胱癌细胞中克隆得到第一个人类癌基因，由于它和之前发现的鼠肉瘤病毒基因c-ras高度同源，故而被命名为ras基因（rat sarcoma）。Ras基因在进化中高度保守，广泛存在于各种真核生物细胞中。哺乳动物的Ras蛋白家族有三个成员，分别是H-ras、K-ras和N-ras。由于Ras蛋白的相对分子量是21 kDa，故又被称为p21。Ras蛋白定位于细胞膜内侧，为GTP/GDP结合蛋白，通过GTP与GDP的相互转化来调节信号通路的传递；之后，人们又发现了Ras的直接效应因子Raf-110，这就将Ras和ERK/MAPK信号通路联系起来。Ras信号通路构成一个复杂的网络。简单地说，被生长因子激活的酪氨酸激酶受体RTKs以直接或间接的方式结合GRB2（growth factor receptor-bound protein 2）。GRB2与受体RTK结合后招募鸟苷酸交换因子SOS蛋白定位在与Ras相邻的细胞膜上。这样，SOS与Ras形成复合体后，GTP取代GDP与Ras结合，Ras被激活；而当GTP被水解成GDP后，Ras失活。Ras蛋白被激活后，产生一系列级联放大反应。首先，它招募细胞浆内的Raf1蛋白至细胞膜上。之后，Raf激酶磷酸化MAPK激酶（MAPKK，又称MEK），再由MEK激活ERK1/2（extracellular signal regulated kinase，又称MAPK）。ERK被激活后，转至细胞核内并直接激活转录因子，产生相应的生物学效应。需要特别指出的是，Raf的激活并不完全依赖于Ras，ERK也能被除Ras之外的其它蛋白激活。这表明信号通路级联反应中的每一个信号蛋白都可能被多个上游蛋白所控制，而它们也可以有多个下游的靶蛋白，从而形成一个极其复杂的网络调控结构。Ras信号致癌的机理。在超过60%的人类恶性黑色素瘤中，都发现了B-raf的激活突变，这种突变还存在于一些直肠癌以及甲状腺和肺部的肿瘤中。B-raf突变后，在某些情况下与C-raf形成异源二聚体，随后持续地激活下游的ERK信号，并最终激活蛋白激酶mTOR。肿瘤细胞中也存在不涉及Ras本身的突变而又持续激活Ras的情况。NF1基因是最早被发现的肿瘤抑制基因之一，它是一个GAP蛋白（GTPase-activating protein）。NF1基因缺失突变后，由于GTP水解的减少而导致GTP结合形式的Ras蛋白的积累，从而提高Ras的活性。除此之外，降低miRNA let-7的表达使靶基因Ras mRNA增加，也能提高Ras的活性。这里所提到的这些蛋白成分都是未来很好的药物靶点分子。20%的人类肿瘤在 Ras 上有激活突变位点 大部分突变发生在 KRas( 约 85%) 在对人类胰脏癌的研究中， 病毒介导的 RNAi 可以用于抗 KRasv12 活性 mTOR（mammalian target of rapamycin）是一类丝/苏氨酸激酶。1991年，人们在酵母中发现了雷帕霉素（rapamycin）的作用靶点，取名为TOR7。与酵母相比，哺乳动物的TOR蛋白在进化和功能上高度保守，也就相应地称为mTOR8。mTOR蛋白的C末端具有激酶活性，它是细胞生长和增殖的关键调节分子，可接收生长因子、营养、能量等多种信号，并通过PI3K/AKT或Ras/ERK信号通路来发挥作用，而对mTOR信号通路的抑制可以使细胞停滞在G1期而触发细胞凋亡。起初，p53被误认为是癌基因，直到上个世纪90年代，人们才认识到引起肿瘤形成或细胞癌变的p53蛋白是p53基因的突变产物。野生型p53基因是一种重要的抑癌基因，它是细胞生长周期中的负调节因子，在细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞分化、凋亡和衰老等许多过程中发挥了重要的生物学功能，因而被誉为“细胞卫士”（如图6）。2) p53信号通路P53 是一种转录因子， 处于多种凋亡通路的连接点位置， 在 50% 的肿瘤细胞中是失活的 p53基因受多种信号因子的调控。例如：当细胞中的DNA损伤或细胞增殖异常时，p53基因被激活，导致细胞周期停滞并启动DNA修复机制，使损伤的DNA得以修复。然而，当DNA损伤过度而无法被修复时，作为转录因子的p53还可进一步激活下游促凋亡基因的转录，诱导细胞凋亡并杀死有DNA损伤的细胞。不然，这些DNA损伤的细胞就可能逐渐脱离正常的调控，有可能最终形成肿瘤。虽然正常状态下p53的mRNA水平很高，而且有大量蛋白质合成，但p53蛋白容易降解，所以正常细胞内p53蛋白水平很低。蛋白的泛素化（ubiquitination）修饰是细胞内蛋白代谢过程中的最普通的降解方式，p53蛋白的降解也是通过泛素化来实现的。MDM2是一种特异性针对p53的泛素化E3连接酶，它可直接与p53蛋白结合来促进p53蛋白的泛素化降解，并在细胞内p53蛋白动态平衡中发挥关键的作用。MDM2本身也可被p53蛋白激活，因此MDM2是p53通路中重要的负反馈调节因子（negative feedback regulator）。3) p53与肿瘤p53基因敲除小鼠虽然可以产生后代，但其生长发育过程中会出现高频率的自发性肿瘤，这提示p53蛋白与肿瘤之间存在密切的关系。事实上，目前TP53基因是与人类肿瘤的相关性最高的基因，与50%以上的人类恶性肿瘤有关，而且现正已在超过51种人类肿瘤病例中发现TP53基因的异常表达和功能失活。TP53基因突变是其功能失活的主要原因，而最常见的突变方式是点突变。此外，某些点突变改变了p53的空间构象，影响了p53蛋白与MDM2和p300等蛋白的相互作用。另一些点突变发生在p53的核定位信号区，使p53无法进入细胞核发挥转录激活的功能。目前看来，在肿瘤形成的复杂网络和调控体系中，p53是最主