细胞内细胞因子的流式检测讲解.ppt

细胞内细胞因子的流式检测,基本概念,细胞内细胞因子染色是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。Th1细胞分泌IFN-g、IL-2、TNF-aTh2细胞分泌IL-4;IL-5;IL-10,技术优势,快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMC灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析安全：减少样本处理与生物源性污染接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况,所需试剂,1、细胞表面染色用的荧光标记的单抗试剂如CD3、CD4、CD8、CD25等2、荧光标记的细胞因子抗体：如IFN-g、TNF-a、IL-2、IL-4等3、溶血素：裂解红细胞4、激活剂：如PMA、Ionomycin，可以刺激T细胞活化并分泌细胞因子,所需试剂,5、阻断剂阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内质网内，以利于准确检测细胞产生细胞因子的能力。MonensinBrefeldin-A(BFA)6、固定剂固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液7、破膜剂将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与相应的细胞因子结合。一般使用含1皂甙、0.05NaN2的Hanks溶液/HBBS,操作步骤,细胞表面抗原染色刺激细胞（PMA、Ionomycin、BFA）固定、破膜细胞因子染色,注意事项,标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN-则可选择PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。,注意事项,选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少应该设置以下对照：未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。,注意事项,使用适当细胞表面阻断试剂，减少非特异性的背景染色，保证结果的准确性Fc受体阻断：使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。表面结合的细胞因子的阻断：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体，阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合引起的背景。荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记,未使用