感受态细胞的制备及检测.ppt

感受态细胞的制备及检测,2010级硕士生：张瑶,2013-6-1,微生物学实验课,感受态细胞（Competentcell）,细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态，经特殊处理后处于此状态的细胞称感受体细胞。,电击法、CaCl2、KCl等化学试剂法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许外源DNA分子进入；进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。,感受态细胞（Competentcell）,常用大肠杆菌感受态细胞的区别,BL21感受态主要用用于蛋白表达的优化实验。,DH5大肠杆菌感受态是一种常用于质粒克隆的菌株,JM109感受态在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZM15进行-互补，从而显示-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。,电击法与CaCl2制备法的区别,电击法:利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部。CaCl2法:利用低渗溶液处理细胞悬浮液微生物细胞膜结构发生变化，使得细胞在热激时（42，90s）变得很容易从溶液中摄取DNA。,感受态细胞可以用来做什么？,-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（-互补）。当这种载体转入可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在IPTG的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质，所以称这种现象为-互补现象。由互补产生的-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物X-gal而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。,蓝白斑筛选,单菌落划线,一、实验目的,二、实验原理,细菌处于0的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的外源DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，在选择培养基上便可获得所需的转化子。,三、实验材料及试剂,超低温离心机,水浴锅,三、实验材料及试剂,恒温金属浴,摇床,三、实验材料及试剂,制冰机,超净工作台,准备物品（按20个感受态计算）(1)50mL离心管2个，洗净，灭菌，干燥，预冷。(2)1.5mL离心管：25个，灭菌，干燥，预冷。(3)LB液体培养基：50mL液体LB放于500mL三角瓶（洗净）中，灭菌。(4)LB液体培养基：3mL液体LB放于小试管中，灭菌。(5)LB固体平板2个，无Amp。(6)氯化钙：0.1M，25mL，灭菌，使用前置于冰浴中预冷称取CaCI22H2O0.37g，定容至25mL(7)氯化钙-氯化镁混合液：（氯化钙20mM，氯化镁80mM）200mL，灭菌，使用前置于冰浴中预冷称取CaCI22H2O0.59g，MgCI26H2O3.25g，定容到200mL(8)甘油：4mL，灭菌，预冷。(或DMSO1mL)(10)颗粒状小冰块。(11)蓝枪头、黄枪头各一盒，灭菌，预冷。(12)LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉16g/L（固体培养基），调节pH至7.0，高压灭菌。,四、实验步骤-感受态制备,(1)划线接种工程菌到LB平板上，培养出单菌落。(2)挑取单菌落至盛有液体LB的小试管中，37过夜培养。(3)将小试管中的菌液转移至盛有50mL液体LB的三角瓶中，37振荡（200r/min）约1h，至呈云雾状，冰浴10min。(4)把菌液倒入预冷的50mL离心管中，（每管放25mL）共2管。(5)4，4500r/min离心10min，充分弃上清。(6)每管加入15mL预冷的氯化钙-氯化镁混合液，重悬细胞，冰浴10min。(7)4，4500r/min离心10min，充分弃上清。(8)每管加入1mL预冷的氯化钙溶液，重悬细胞，冰浴10min。(9)每管加入0.25mL预冷的无菌甘油，冰浴10min，分装到20个1.5mLEP管中，每个EP管分装100L，放于-70冰箱中，备用。注：第8步可以加入DMSO替换甘油作为保护剂。,四、实验步骤-感受态检测,1）连接,2）转化,纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接（16，8-10h）,从冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，置冰上缓缓融化；将连接产物（10L）全部加入100L感受态中，混合均匀，冰浴30min；42热激90s，冰浴2min；42热激1min，冰浴2min；加入800l液体LB培养基(不含Amp)，37摇床培养1-1.5h；4000r/min离心5min，弃上清，剩余约100L；凃布氨苄LB固体平板（氨苄终浓度为100g/mL），37正置30min，再倒置培养12h左右；,3）蓝白斑筛选，菌落PCR验证,四、实验步骤-感受态检测,五、实验注意事项,细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从-80甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，也可通过监测培养液的OD600来控制。密度过高或不足均会影响转化效率。实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。感受态细胞制备过程中均需