2009分子生物学实验技术3.ppt

分子生物学实验三,Contents,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,常规PAGE不连续PAGESDS-PAGE固相pH梯度IEF(IPG-IEF)双向电泳,凝胶聚合原理,化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。光聚合,核黄素B1还原型游离基聚合反应,光照,O2,凝胶的孔径,单体和双体在凝胶中的总浓度,a+b,V,100%,T,双体占总浓度的百分含量，即交联度,b,ab,100%,C,a，Acr的质量（g）b，Bis的质量（g）V，溶液的体积（ml）,C6.5-0.3TT：520,孔径大小,蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系,凝胶浓度的选择,不连续PAGE的分离效应,浓缩效应分子筛效应电荷效应,可分离：1.电荷性质与密度相近的但分子量有差别2.分子量相近、性质一样、电荷与密度有差别的分子3.电荷性质、分子量大小相近，但构型不同,浓缩效应,1.缓冲液与凝胶的离子成分和pH值不同。Cl-，Gly-，蛋白质离子。快慢离子迁移快慢的差别造成电场强度与电导率的变化。低导电区和高导电区。蛋白质样品迁移率在快慢离子之间，压缩聚集成一条窄带。2.两层凝胶的孔径不同：浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶,分子筛效应,移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的pH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，直至完全解离出gly-,其分子量小，迁移超过蛋白质分子。而丧失夹击的作用；同时，凝胶的孔径变小，降低了蛋白质的迁移率。故蛋白质分子在均一的电压梯度和pH值中泳动，依其分子量的大小而分开。,电荷效应,蛋白质所带的净电的性质和电荷量与分子的迁移率的关系，在同一电场强度中，在单位时间内各分子迁移的距离的差别而到达分离。,重组蛋白在原核生物中诱导表达的SDS-PAGE鉴定(B菌),实验原理,SDS-PAGE：消除电荷对蛋白质样品迁移率的影响，电泳迁移率取决于蛋白质的分子量大小。SDS是一种阴离子去垢剂，溶液中带负电荷。SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，蛋白质解聚为单一多肽。蛋白质多肽与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块。,影响因素,溶液中SDS单体的浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单体浓度低于0.5mmol/L，两者的结合比仅为1:0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10100mmol/L用SDS处理样品同时用巯基乙醇或DTT处理，完全还原蛋白质内的二硫键，使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。,实验试剂和器材,1.材料：低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白MW=66,200兔肌动蛋白MW=43,000牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制剂MW=20,100鸡蛋清溶菌酶MW=14,4002.试剂（略）,12分离胶的制备：15mlddH2O4.8ml30%凝胶储存液6.0ml分离胶缓冲液（pH8.8）3.8ml10SDS150l10AP150l10TEMED100l,浓缩胶的制备：5mlddH2O3.34ml凝胶储存液0.83ml浓缩胶缓冲液（pH6.8）0.63ml10SDS50l10AP50l10TEMED100l,操作步骤,1.将干净玻璃板在灌胶支架上固定好.固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.2.按比例在烧杯中配好分离胶,用滴管快速加入,之后加少许蒸馏水封胶,静置3040min.配制凝胶要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝胶无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免凝胶不均匀.,操作步骤,封水的目的是为了使分离胶上沿平直，并隔绝空气，促使凝胶聚合过程；凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入分离胶面上,迅速插入样梳,静置30min.样梳需平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.,操作步骤,5.拔出样梳。插入电泳槽，倒入缓冲液体，用缓冲液冲洗样品孔要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.6、用微量移液器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热10分钟。注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样品下沉时会发生扩散.为避免边缘效应,最好选用中部的孔上样.,操作步骤,8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在80V，当进入分离胶后改为150V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，取出凝胶，考马斯亮蓝染色，做好标记后准备蛋白印迹。剥胶时要小心,保持胶完好无损.,注意事项,没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近一定要催化充分，使之完全聚合集中处理，实验中全部的胶专门收集到一起，在一个特殊标明的容器中保存，统一处理。聚丙烯酰胺通常认为无毒，但是也要小心操作，因为其中可能留下少量没有聚合的单体。,重组DNA的酶切分析目的基因非变性PAGE鉴定,1.实验目的和要求学习和掌握限制性内切酶的特性、酶切分析和DNA非变性PAGE鉴定的操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，非变性PAGE是高分辨率分离鉴定小分子双链DNA片段的有效方法。,2.相关基础知识限制性核酸内切酶(RestrictionEndonuclease，RE)：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。RE不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。,1)寄主控制的限制与修饰现象2)核酸限制性内切酶的类型、命名法3)核酸限制性内切酶的基本特性4)同裂酶和同尾酶5)影响核酸限制性内切酶活性的因素,1)寄主控制的限制与修饰现象,限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种核酸内切酶，用来限制外源DNA存在于自身细胞内，但细胞自身的DNA不受影响，因为细胞内还合成了一种修饰酶，能对自身的DNA进行修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。,2)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：型型*型,第一类（I型）限制性内切酶:能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大。,第二类(II型)限制性内切酶:能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类RE的识别和切割的核苷酸都是专一的,因此,是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个、7个、8个、9个、10核苷酸的。II型RE的识别顺序是回文对称顺序。酶的切割可有两种结果：平头末端、粘性末端。,第三类（III型）限制性内切酶:也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,Hind,Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,EcoRIisfromEscherichiacoli.,3）限制性核酸内切酶的命名法,同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，有时其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都是5GCG_G3，如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Hpa能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。,4）同裂酶和同尾酶：,+,BamH,+,Bst,同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。,BamH,Bgl,+,+,可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如Xba1、Nhe1以及Spe1切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点，即Bfa1的酶切位点。,5)影响核酸限制性内切酶活性的因素(1)DNA的纯度；(2)DNA的甲基化程度；(3)酶切消化反应的温度；(4)DNA的分子结构；(5)溶液中离子浓度及种类；(6)缓冲液的pH值。,HindIII1ulBamHI1ul10XBuffer2ulPlasmidDNA6-8ulddH2O10-8ul*缓冲液随不同的酶而不同。,置于37水浴酶切1-2hr（7h）。,质粒DNA的酶切（自提质粒）,实验步骤：,DNA酶切片段的非变性PAGE鉴定,凝胶的配制：10ml30凝胶储存液2