动物胚胎工程复习资料

补充内容：一动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。动物细胞培养的条件1.无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。2.营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因子等）3.血清和血浆 (提供细胞生长必须的营养成份)4.温度和pH（36.50.5，7.27.4）5.气体环境（95%的空气+5%CO 2的混合气体）其中5%CO2气体是为保持培养液的pH稳定体外细胞培养所需营养物质与体内基本相同，例如，需要糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等。将细胞所需的上述物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，因此在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。基本过程取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。再配成一定浓度的细胞悬浮液。另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株。当培养超过50代时，大多数的细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变出现了无限传代的特性，即癌变。此时的细胞被称为细胞系。方法消化法 消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡23秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。2、用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hanks液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入56倍的0.25%胰酶液，37中消化2040分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。5、加入35ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。6、静置510分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。8、加入Hanks液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。9、加入培养液l2 ml（视细胞量），血球计数板计数。10、将细胞调整到5105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37下培养。组织块法 自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。于37静置35小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37继续培养。分类根据细胞种类：原代细胞培养， 传代细胞培养原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。传代培养中的细胞传代培养（subculture），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。原代细胞：将动物各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA) 或机械方法处理，分散成单细胞，在合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。培养的细胞为正常的动物细胞，一般培养3-5代后不再增殖，死亡。传代细胞：传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传代。传代培养可获得大量供实验所需细胞。细胞传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细地无菌操作。培养的细胞为癌变或人为癌化的细胞，理论上可以无限增殖。癌化的方式有很多：进行癌基因突变，感染病毒，从癌症供体体内分离，物理或化学方法（如紫外，化学试剂）等。2 根据培养方式：贴壁细胞培养，半悬浮细胞培养，悬浮细胞培养细胞转染细胞转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。方法：ppt二胚胎发育精子发生血睾屏障是动物睾丸中血管和精细管之间的物理屏障。 一屏障是由精细管支持细胞塞尔托利氏细胞（Sertoli Cell）之间的紧密连接形成。它为精原细胞提供营养。血睾屏障防止细胞毒性物质（对细胞有毒的个体或物质）进入精细管。作用：形成免疫屏障。因为精子是一种抗原，血睾屏障能够阻挡精子的抗原性，不让身体产生抗精子的抗体，避免发生自身免疫反应。 防止有害物质干扰精子发生和损害已形成的精子。 为精子产生创造良好环境，保证精子发生有一个正常的微环境。 睾丸的支持细胞是血睾屏障组成的一个重要结构，睾丸的支持细胞，分布在各期生精细胞之间，呈锥体形，底部较宽，贴附于基膜，顶部狭窄，伸入管腔。细胞顶部和侧壁形成许多凹陷，其中镶嵌着生精细胞。细胞核呈不规则形，染色浅，核仁明显。相邻的支持细胞基部侧突相接，两侧细胞膜形成紧密连接。此连接位于精原细胞上方，可阻挡间质内的一些大分子物质穿过曲细精管上皮细胞之间的间隙进入管腔，因而起到屏障作用。全部精子发生过程可以被分为 3 个过程：精原细胞位于生精上皮的基底部，分为 A 、 B 两种类型。 A 型精原细胞进一步分为 Ad 型和 Ap 型精原细胞。在正常情况下， Ad 型精原细胞不发生任何有丝分裂，应该被视为精子发生的精原干细胞； Ap 型精原细胞则通常分化增殖为两个 B 型精原细胞。 B 型精原细胞分裂增殖为初级精母细胞，随后，初级精母细胞开始 DNA 合成过程。精母细胞经历了减数分裂的不同阶段。粗线期时 RNA 的合成十分活跃。减数分裂的结果产生单倍体生精细胞，又称精子细胞。在精子生发过程中，减数分裂是一个非常关键的过程，在这个阶段，遗传物质相互重组、染色体数目减少并最终形成精子细胞。次级精母细胞产生于第一次减数分裂后。这些生精细胞含有双份单倍体染色体。在第二次减数分裂精母细胞演变为单倍体的精子细胞。第一次减数分裂前期大概持续 1 3 周，而除此之外的第一次减数分裂的其他阶段和第二次减数分裂在 1 2 天之内完成。第二次减数分裂后形成精子细胞，是没有减数分裂活性的圆形细胞。圆形的精子细胞经过复杂的显著变化转变为不同长度的精子细胞和精子。在第二次减数分裂中，细胞核发生的聚缩和塑性，同时鞭毛形成和胞浆明显扩张。全部精子细胞变形的过程称为精子形成。卵子发生卵子发生(oogenesis)从胚胎发育早期开始，经过胚胎期、出生、直至性成熟才完成。具体变化为，由原始生殖细胞形成到卵原细胞(oogonia)，再由卵原细胞形成成熟卵细胞的过程。变化过程1原始生殖细胞的起源与迁移原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）在胚盘原条尾端部形成，后到达内胚层，随后以阿米巴样运动迁移到胚胎两侧的生殖脊上皮内。迁移过程中PGCs不断分裂增殖。2卵原细胞的形成PGCs进一步迁移到未分化性腺的原始皮质中，与其他生殖上皮细胞一起形成原始性索。之后PGCs发生形态学变化转化为卵原细胞，并进入卵原细胞的增殖期(proliferation phase)，在该期，卵原细胞通过有丝分裂增加细胞数量。3初级卵母细胞的形成和原始卵泡发生卵原细胞增殖到一定时期，有些细胞开始进入第一次减数分裂的细线期成为初级卵母细。初级卵母细胞从细线期经偶线期、粗线期、双线期到达核网期后细胞分裂周期被打断，此时卵母细胞的核较大，成为生发泡（germinal vesicle），并处于静止状态。此时卵母细胞周围包有一层扁平的前颗粒细胞，形成原始卵泡，并由他们形成初级卵泡。此后卵泡进入生长和发育阶段，而卵母细胞在卵泡内生长发育直至成熟排卵。受精：精子与卵细胞融合成为受精卵的过程，叫做受精作用。在受精作用进行时，通常是精子的头部进入卵细胞。尾部留在外面。紧接着，在卵细胞细胞膜的外面出现一层特殊的膜，以阻止其他精子再进入。精子的头部进入卵细胞后不久，里面的细胞核就与卵细胞的细胞核相遇，使彼此的染色体会合在一起。这样，受精卵中的染色体数目又回复到体细胞中的数目，其中有一半的染色体来自精子（父方），另一半来自卵细胞（母方）。受精过程大致是：次级卵母细胞需发育至减数第二次分裂中期才具备受精能力。获能的精子与该时期的次级卵母细胞相遇后。发生顶体反应，释放出顶体酶，溶解卵丘细胞间的物质，形成一条通道。随后，与透明带接触，顶体酶在透明带中再次溶出一条孔道。精子通过顶体酶溶解出的两条通道与卵黄膜接触，立即发生透明带反应以妨碍其他精子通过透明带，这是防止多个精子进入卵细胞的第一道屏障。精子与卵黄膜接触后，被其表面大量的微绒毛抱合，随后，精子外膜与卵黄膜发生融合（利用了细胞膜的流动性这一特征），精子的尾脱落，细胞核进入卵细胞。精子入卵后，卵细胞随即发生卵黄膜封闭作用（是阻止多精受精的第二道屏障）并被激活进行减数第二次分裂，排出第二极体。同时发生的还有，精子的细胞核核膜破裂，重新形成一个更大的细胞核，称雄原核。减数第二次分裂后的卵细胞形成的细胞核，称雌原核（通常雄原核比雌原核大）。两原核相互靠近并彼此融合，最后则形成了一个二倍体（对人和大多数哺乳动物而言）合子，受精过程基本完成。注：受精过程在输卵管中完成。卵裂：精子与卵子结合之后会形成受精卵，由于卵黄的分布具有不对称的特性，因此受精卵可以分为动物极（会发展成外胚层）和植物极（会发展成中胚层与内胚层）。在卵裂时期，受精卵会先分裂成两个细胞，之后细胞通常会逐次倍增，但是对哺乳类而言，有时候会有不同时分裂并造成只有奇数个细胞的现象。在这个阶段，胚胎的总体积大致不变。细胞分裂成16到32个细胞的阶段，称为桑椹胚（morula），在这个阶段，动物极的分裂频率会超越靠近植物极且具有卵黄的细胞群。到了32个以上细胞数目的阶段，称为囊胚（blastula），囊胚内部靠近动物极的区域会形成一个囊胚腔。体外受精体外受精(In Vitro Fertilization)或（external fertilization）是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。由于它与胚胎移植技术(ET)密不可分，又简称为IVF-ET。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tube animal)。这项技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术引。三核移植核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育，让核供体的基因得到完全复制。培养一段时间后，在把发育中的卵母细胞移植到人或动物体内的方法。核移植的细胞来源主要分为：供体细胞来源和受体细胞的来源两种。核移植主要用于细胞移植和异种器官移植，细胞移植可以治疗由于细胞功能缺陷所引起的各种疾病。具体方法1供体核的获得 培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。2受体细胞去核用M中期卵母细胞做受体细胞原因： 细胞体积大,易于操作; 含有促进细胞核全能性表达的物质和 营养条件。 为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。3核卵重组 4细胞融合/激活 5重构胚培养与移植克隆先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后，再被植入动物子宫中使动物怀孕，便可产下与提供细胞核者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。 克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。治疗性克隆（therapeutic cloning）治疗性克隆指把患者植体细胞移到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞），用于替代疗法。这种方法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体。运用克隆技术获得人体早期胚胎，但目的不是将胚胎培育成人，而是为了提取全能型的胚胎干细胞，然后在合适的条件下，使其发育成为人体的任何一个器官，包括大脑、肌肉、血液和神经，这些器官组织将用于医疗。目前治疗性克隆已获得不少国家的默许。生殖性克隆（reproductive cloning）就是以产生新个体为目的的克隆。即用生殖技术制造完整的克隆人。目的是产生一个独立生存的个体。于此相对的是研究性克隆或医学性克隆，指的是产生研究所用的克隆细胞。不产生可独立生存的个体。克隆人，真的如潘多拉盒子里的魔鬼一样可怕吗？实际上，人们不能接受克隆人实验的最主要原因，在于传统伦理道德观念的阻碍。千百年来，人类一直遵循着有性繁殖方式，而克隆人却是实验室里的产物，是在人为操纵下制造出来的生命。尤其在西方，“抛弃了上帝，拆离了亚当与夏娃”的克隆，更是遭到了许多宗教组织的反对。而且，克隆人与被克隆人之间的关系也有悖于传统的由血缘确定亲缘的伦理方式。所有这些，都使得克隆人无法在人类传统伦理道德里找到合适的安身之地。但是，正如中科院院士何祚庥所言：“克隆人出现的伦理问题应该正视，但没有理由因此而反对科技的进步”。人类社会自身的发展告诉我们，科技带动人们的观念更新是历史的进步，而以陈旧的观念来束缚科技发展，则是僵化。历史上输血技术、器官移植等，都曾经带来极大的伦理争论，而当首位试管婴儿于1978年出生时，更是掀起了轩然大波，但现在，人们已经能够正确地对待这一切了。这表明，在科技发展面前不断更新的思想观念并没有给人类带来灾难，相反地，它造福了人类。就克隆技术而言，“治疗性克隆”将会在生产移植器官和攻克疾病等方面获得突破，给生物技术和医学技术带来革命性的变化。比如，当你的女儿需要骨髓移植而没有人能为她提供；当你不幸失去5岁的孩子而无法摆脱痛苦；当你想养育自己的孩子又无法生育也许你就能够体会到克隆的巨大科学价值和现实意义。治疗性克隆的研究和完整克隆人的实验之间是相辅相成、互为促进的，治疗性克隆所指向的终点就是完整克隆人的出现，如果加以正确的利用，它们都可以而且应该为人类社会带来福音。四RNA 沉默(RNA silencing)或基因沉默(gene silencing)是广泛存在于植物、动物、线虫和真菌等真核生中的一种高度保守的、序列特异的 RNA 降解机制. RNA 沉默对于调控发育、维持基因组的稳定性以响应生物和非生物胁迫等具有重要作用.作用植物可利用 PTGS 和 TGS 来抵抗病毒侵染, 病毒侵染植物后会产生大量病毒来源的小 RNA (virus-derived small interfering RNAs, vsiRNA), 介导对病毒 RNA 的降解或抑制病毒基因的转录; 而在与植物长期共进化过程中, 病毒编码一个或多个RNA沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing, VSR)来抑制植物的基因沉默, 从而逃脱植物的这种防卫反应. 近年来, 针对病毒基因沉默抑制子作用机制的研究表明, 病毒编码的基因沉默抑制子通过与植物基因沉默通路中的RNA或者关键蛋白分子相互作用, 抑制植物对病毒的抵抗, 干扰植物正常的基因表达调控. 深入了解 vsiRNAs 的起源与组成、调控基因表达的潜力, 以及病毒编码的基因沉默抑制子的作用机制, 将有助于我们更好地了解植物与病毒之间是通过怎样复杂的相互作用来实现共同进化的, 进而为植物病毒控制提供新的策略.五转基因动物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。现有的应用于动物乳腺生物反应器制备的转基因技术主要有：1 显微注射法2 逆转录病毒介导法3 配子介导法4 胚胎干细胞（ES）介导法5 核移植介导法还有利用同源重组原理发展起来的基因打靶（敲除）技术，结合体细胞克隆，正成为动物乳腺生物反应器制备的新研究热点。转基因技术（Genetically Modified，简称GM），是指运用科学手段，将基因片段转入特定生物中，并最终获取具有特定遗传性状个体的技术。转基因技术的理论基础来源于分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有特定的遗传性状个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。转基因过程(1)从生物有机体复杂的基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段；或者人工合成目的基因。(2)在体外, 将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上， 形成重组DNA分子。(3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞) 。(4)带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖体。(5)从大量的细胞繁殖群体中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。(6)将选出的细胞克隆的目的基因进一步研究分析,并设法使之实现功能蛋白的表达。载体（vector） ，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。必备条件在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，且对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入。含有复制起始位点，能够独立复制；通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。载体DNA分子大小应合适，以便操作。基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，