三大类病毒表达载体

病毒表达载体 技术支持：龙桂根 Gene Gene expression system Gene delivery system Gene vector system 杰特伟杰特伟 哺乳动物表达载体的特点； 特点特点：哺乳动物细胞表达载体元件包含（1）原核序列、（2） 启动子、增强子、（3）选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号 等。 选用哺乳动物表达载体的优势：选用哺乳动物表达载体的优势： 由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方 面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更 接近于天然蛋白质。 更 接近于天然蛋白质。 杰特伟杰特伟 外源基因进入哺乳动物细胞的方法 将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法 ： 一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞，一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞， 二是通过脂质体法、显微注射法 、磷酸钙共沉淀法及二是通过脂质体法、显微注射法 、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法 等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中 一葡聚糖法 等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。外源基因的体外表达一般采 用质粒表达载体，如将重组质粒导入CHO细胞可建 立高效稳定的表达系 统，而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。 目前，病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具，在临床基因 治疗的探索中也发挥了重要 作用。 痘苗病毒由于其基因的分子量相当大(约187kb)，利用它作为载体可同时 插入几种外源基因，从 而构 建多价疫苗。另外，逆转录病毒感染效率 高，某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因，但要注意的是逆转 录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险 性。 三大类病毒表达载体 一；腺病毒（adenoviral)表达载体 二；逆转录病毒(retroviral)表达载体 三；慢病毒表达(lentiviral)载体 四；三大类病毒表达载体的差异与联系 五；其它病毒表达系统 杰特伟杰特伟 腺病毒表达载体 产生的背景；产生的背景；人们希望基因能在哺乳动物细胞 中表达目的 基因，而传统的办法做不到。 腺病毒腺病毒是一种线状DNA肿瘤病毒，基因组内有14个基因。目前 对该病毒的分子生物研究已经很深入，而且对该病毒转染后的免 疫应答也了解佷清楚，目前应用范围最广的病毒，其转染效率也 很高，不管是分裂细胞，还是静止细胞，都是如此。 缺陷缺陷：不能整合至靶细胞的基因组，只能瞬时表达，更为致命 是腺病毒的某些抗原表达，也很容易引起人体的免疫反应。 杰特伟杰特伟 逆转录病毒载体系统 选用的背景选用的背景：由于重组腺病毒对于一些细胞类型难以转染，比如 各种类型的原代细胞、体内细胞，同时希望基因永久性表达，即将基 因整合入靶细胞的基因组中，此时可以考虑选用逆转录病毒。 逆转录病毒简介逆转录病毒简介： 反转录病毒载体是常用的病毒载体之一，是 由具有感染性的小鼠的白血病病毒改造而来，能将非病毒基因导入细 胞体内或体外进行有丝分裂。这些载体能产生病毒基因组的单一拷贝 并高效准确地整和到宿主染色体 。 杰特伟杰特伟 慢病毒 慢病毒慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基 础发展起来的基因治疗载体。 区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能 力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将 外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能 力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮 细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在 美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景 杰特伟杰特伟 病 毒 载 体生 物 学 特 性适 用 范 围病 毒 载 体生 物 学 特 性适 用 范 围 反 转 录 病 毒 载 体反 转 录 病 毒 载 体 单 链单 链 R N A 病 毒病 毒 810k b 可 感 染 分 裂 细 胞 ； 整 合 到 染 色 体 中 ； 表 达 时 间 较 长 ； 有 致 癌 的 危 险 ； 可 感 染 分 裂 细 胞 ； 整 合 到 染 色 体 中 ； 表 达 时 间 较 长 ； 有 致 癌 的 危 险 ； E x vivo 基 因 治 疗 ； 肿 瘤 基 因 治 疗 。 基 因 治 疗 ； 肿 瘤 基 因 治 疗 。 腺 病 毒 载 体腺 病 毒 载 体 双 链双 链 D N A 病 毒病 毒 36k b 可 感 染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 ； 不 整 合 到 染 色 体 中 ； 外 源 基 因 表 达 水 平 高 ； 表 达 时 间 较 短 ； 免 疫 原 性 强 ； 可 感 染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 ； 不 整 合 到 染 色 体 中 ； 外 源 基 因 表 达 水 平 高 ； 表 达 时 间 较 短 ； 免 疫 原 性 强 ； In vivo 基 因 治 疗 ； 肿 瘤 基 因 治 疗 ； 疫 苗 。 基 因 治 疗 ； 肿 瘤 基 因 治 疗 ； 疫 苗 。 A AV 病 毒 载 体病 毒 载 体 单 链单 链 D N A 病 毒病 毒 5k b 可 感 染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 ； 整 合 到 染 色 体 中 ； 无 致 病 性 ； 免 疫 原 性 弱 ； 可 长 期 表 达 外 源 基 因 ； 在 骨 骼 肌 、 心 肌 、 肝 脏 、 视 网 膜 等 组 织 中 表 达 较 高 ； 可 感 染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 ； 整 合 到 染 色 体 中 ； 无 致 病 性 ； 免 疫 原 性 弱 ； 可 长 期 表 达 外 源 基 因 ； 在 骨 骼 肌 、 心 肌 、 肝 脏 、 视 网 膜 等 组 织 中 表 达 较 高 ； In vivo 基因治 疗 ； 基因治 疗 ； E x vivo 基 因 治 疗 ； 遗 传 病 基 因 治 疗 ； 获 得 性 慢 性 疾 病 的 基 因 治 疗 。 基 因 治 疗 ； 遗 传 病 基 因 治 疗 ； 获 得 性 慢 性 疾 病 的 基 因 治 疗 。 H S V 病 毒 载 体病 毒 载 体 双 链双 链 D N A 病 毒病 毒 152k b 具 有 嗜 神 经 性 ； 可 逆 轴 突 传 递 ； 可 潜 伏 感 染 ； 容 量 大 ； 可 感 染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 ； 神 经 系 统 疾 病 的 基 因 治 疗 ； 肿 瘤 的 基 因 治 疗 。 具 有 嗜 神 经 性 ； 可 逆 轴 突 传 递 ； 可 潜 伏 感 染 ； 容 量 大 ； 可 感 染 分 裂 和 非 分 裂 细 胞 ； 神 经 系 统 疾 病 的 基 因 治 疗 ； 肿 瘤 的 基 因 治 疗 。 常用的病毒载体的特点：常用的病毒载体的特点： 杰特伟杰特伟 基因载体系统基因载体系统 病毒载体系统病毒载体系统非病毒载体系统非病毒载体系统 腺病毒载体腺病毒载体 反转录病毒载体反转录病毒载体 腺伴随病毒载体腺伴随病毒载体 单纯疱疹病毒载体单纯疱疹病毒载体 慢病毒载体慢病毒载体 裸DNA裸DNA DNA-DNA-阳离子脂质复合物 阳离子脂质复合物 DNA-蛋白质复合物DNA-蛋白质复合物 细胞内包装细胞内包装细胞外包装细胞外包装 DNA-阳离子多聚物DNA-阳离子多聚物 DNA/RNA嵌合物DNA/RNA嵌合物 杰特伟杰特伟 公司相应的病毒表达载体 质粒siRNA 表达载体 去除去除CMV启 动子 和 启 动子 和EGFP荧 光蛋白， 质粒较小， 最好 使用 的 荧 光蛋白， 质粒较小， 最好 使用 的 RNAi质粒之一质粒之一 杰特伟杰特伟 质粒siRNA 表达载体 CMV启 动子 和 启 动子 和EGFP荧 光蛋白 荧 光蛋白 杰特伟杰特伟 诱导性的siRNA 表达启动子 四环素四环素 强力霉素强力霉素 杰特伟杰特伟 Tet-on基因表达系统的小常识 Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系 统 。 随后Gossen等对tTA的氨基酸序列进行了改造，构建了 受四环素正调节的Tet-on基因表达系统，该系统在没有 四环素的情况下启动子不被激活， 没有 四环素的情况下启动子不被激活，而 在加入四环素或强 力毒素后目的基因高效表达。 四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动 物细胞诱导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性 强的优 点。 杰特伟杰特伟 诱导性的siRNA 表达启动子杰特伟杰特伟 腺病毒siRNA穿梭载体 主要分为两大类： 一； 与clontech 的adeno-x expression系统兼容 二； 与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容 杰特伟杰特伟 与clontech 的adeno-x expression系统兼容 去除去除CMV启动子 和 启动子 和EGFP荧光蛋白， 质粒较小， 最好使用的 荧光蛋白， 质粒较小， 最好使用的RNAi 质粒之一。避免了质粒之一。避免了E GFP荧光蛋白 对 荧光蛋白 对RNAi实验检 测可能造成的冲突。 实验检 测可能造成的冲突。 杰特伟杰特伟 与clontech 的adeno-x expression系统兼容杰特伟杰特伟 与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容杰特伟杰特伟 与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容 注意到，此载体 集金思特 注意到，此载体 集金思特 siRNA载体 的所有特色； 载体 的所有特色； 1.诱导性启动子诱导性启动子 2.与与strata