胶体金试纸条的制备.ppt

免疫胶体金技术简介,Immunecolloidalgoldtechnique2015-1-27,目录,胶体金技术的发展,胶体金免疫层析（GoldImmuneChromatographicAssay,GICA）技术是结合了胶体金技术和免疫层析技术发展而来的，其本质为一种固相反应的ELISA,并用胶体金来代替底物显色。免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。,胶体金技术的发展,1939-雏形Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。1971-作为标记物应用于免疫组织化学研究Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。1974-实现间接免疫金染色法Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法,胶体金技术的种类及优点,快速免疫金渗滤法(immuogoldfiltrationassay,IGFA)即穿流式(flowthrough)的固相膜免疫测定。主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。,A：金标记抗体B：标本中的抗原C：包被抗体D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒,免疫层析法(immunochromatogra-phy，ICA)是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流（lateralflow）)向另一端移动。移动过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。,免疫胶体金技术的特点,优点：检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定；无污染；GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。,成为目前“病人身边检验”（point-of-caretesting，POCT）中广为应用的方法。,最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器CardiacReader，其精密度和准确性均符合定量测定要求。,不足：金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用。,胶体金的合成,白磷还原法(1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒；白磷还原法(1925年)经改良后，可合成512nm大小的金颗粒；抗坏血酸还原法(1958年)可合成613nm大小的金颗粒；柠檬酸三钠还原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金颗粒；乙醇超声波还原法(1980年)可合成610nm大小的金颗粒；硼氢化钠还原法(1982年)可合成317nm大小的金颗粒；单宁酸柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成317nm大小的金颗粒。,胶体金合成,将100ml的0.1H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液加热至沸腾。向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1二合水柠檬酸三钠，Na3C6H5O7.2H2O当获得深红颜色的溶液时停止加热,制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法,胶体金的合成,注意事项（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。,胶体金的质量鉴定,优质金颗粒和劣质金颗粒,劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大。,透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度,理想的金颗粒大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。,双电层结构保证了胶体金的稳定性，使金颗粒始终以悬浮状态存在。胶体金溶液通常由呈单一分散状态的金颗粒组成，金颗粒直径在1-100nm之间，而稳定的金溶液则要求金颗粒维持在某一固定直径不变。,蛋白通常带有多种电荷，当蛋白带正电时，能与胶体金所带的负电荷相互作用；而蛋白中的疏水氨基酸能通过疏水作用将蛋白结合至金颗粒表面；有些蛋白则可通过半胱氨酸的巯基与金颗粒共轭连接。,胶体金的蛋白标记,金标样本程序,将胶体金调整至正确的pH值确定最小蛋白含量最终结合（标记）纯化,胶体金调整正确的pH值,胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1NHCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.,常见蛋白标记条件,最小蛋白用量的确定,（1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml10%NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45g/ml。,（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5g45g另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述各管内分别加入0.1ml10%氯化钠，依表顺序进行。,发现1、2号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3号管虽然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而4、5号管颜色无变化与对照颜色一致，最低蛋白量即为4号管的蛋白量。,最终结合（McAb）,取100ml金溶液，调整pH值至8.2调整滤过和离心的抗体溶液（0.1g/l）至pH8.2当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的抗体（蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定量），大约5分钟加完在金标溶液中加入10ml滤过的10BSA至终浓度为1%，并轻轻搅拌10分钟。,纯化,超速离心法、凝胶过滤法,几种免疫金探针离心纯化条件,胶体金免疫层析法试剂的组成,样品垫(Samplepad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。样品垫的作用：减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布；去除样品中杂质颗粒；调节样品液pH值或粘度等。,样品垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差异，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。,结合垫(Conjugatepad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。结合垫的作用主要为：-吸附一定量的金标结合物颗粒；-吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上；-保持金标结合物颗粒的稳定性；-保证金标结合物颗粒定量完全释放等。,玻璃纤维膜/聚酯纤维膜,硝酸纤维素膜(Nitrocellulose)：一般使用Millipore，MDI，S&S，whatman等国外公司的硝酸纤维素膜。NC膜的作用：-在检测线和对照线条带区域固定抗体；-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；-反应在NC膜上显色，读检测结果NC膜的重要参数：孔径、对称性、层析速度、表面活性剂、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均一性等。,硝酸纤维膜的选择,膜的分类标准(m和s)m:指的是膜孔径换算情况大致为：8m=135s；6m=180s不同秒数的膜对反应的影响通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法.,片材：不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了产品的货架期。,吸收垫(AbsorbentPad)：提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸收纸；吸收纸的作用：主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。,胶体金免疫层析试纸模式,双抗体夹心模式疫病抗原检测竞争模式小分子物质检测SPA/蛋白G模式疫病抗体检测,双抗体夹心模式,竞争模式,SPA/G蛋白模式,胶体金免疫层析试纸质量检测,胶体金免疫层析试纸的应用,在兽药残留检测中的应用Zhang等用克伦特罗制备的单克隆抗体标记胶体金作为检测探针，然后将偶联BSA的克伦特罗作为T线，以竞争模式组装成试纸，用于样品的克伦特罗残留检测，为我国食品安全检测提供了有效的工具。之后Zhang的团队采用同样的模式制备并组装成功两类兽药残留检测试纸，分别为磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星残留检测胶体金免疫层析试纸，为我国兽药残留快速检测技术的发展奠定了基础。在兽医疫病检测中的应用Bhakar等应用相应的单抗标金，建立了阿米巴虫抗原检测方法。Kameyama等以牛病腹泻病毒的NS3蛋白制备单克隆抗体，并用胶体金标记单抗制备胶体金试