细菌营养缺陷型的诱变和筛选

微生物大实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要 用某些物理因素或是化学因素，使基因发生突变，丧失合成某一物质的能力，因而它们在基本培养基上不能生长，必须补充某些物质才能生长，这样从野生菌经诱变筛选到的菌株，称为营养缺陷型。紫外线可以诱导细菌发生突变，产生营养缺陷型菌株。筛选营养缺陷型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理、营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化。又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离到突变型。关键词 紫外诱变 营养缺陷型 营养缺陷型的检出 划线复证 生长谱鉴定引言营养缺陷型：需要在基本培养基中补加某种营养成分（如氨基酸、维生素、核苷酸等）才能生长的微生物突变体，通过基因突变产生。微生物细胞本身能吸收周围环境中的简单营养物，经过自身代谢合成生长所需的各类营养物质。如果发生基因突变，则细胞失去合成与这些基因有关营养物质的能力，只有在培养基中补加这类营养物质后，突变细胞才能生长，故又名营养缺陷型突变体。此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是研究代谢途径和遗传规律必不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。影印接种法：将待测的浓缩菌悬液涂在完全培养基平板上，待其长好后作为母平板。用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，作为接种工具。用它在母平板上轻轻印一下，再在基本培养基平板上印一下，经培养后，影印平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较二个平板上菌落的生长状况，即可从相应位置的母平板上选出待测的营养缺陷型菌株。夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基，冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底的相应位置做上标记，然后再加一层完全培养基。再经培养后出现的菌落，多数是只能在完全培养基上生长的营养缺陷型。青霉素浓缩法：利用青霉素特异性的杀死野生型细胞，保留营养缺陷型细胞的方法。青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，所以只能杀死生长繁殖中的细菌，而不能杀死停止繁殖的细菌。在基本培养基中添加青霉素，野生型细菌能够生长繁殖，会被杀死，而营养缺陷型不被杀死，得以浓缩。本实验采取的筛选方法就是青霉素浓缩法。诱变育种是人为地采用物理、化学的因素，诱导有机体产生遗传变异，并经过人工选择、鉴定、培育新品种的方法。诱变育种的目标是改变或增加一个满意品种的某一特性，而在其他方面保持不变。诱变育种具有以下特点：1）提高突变率，扩大变异谱；2）适于进行个别性状的改良；3）育种程序简单，年限短；4）变异的方向和性质不定。在诱发突变中，有两类诱变剂被使用：物理的和化学的。物理诱变中应用较多的是辐射诱变，即用射线、射线、射线、射线、中子和其他粒子、紫外辐射等物理因素诱发变异。近年来又开发了一些新的物理诱变手段，如激光辐射诱变、离子注入诱变、空间诱变等。化学诱变剂在染色体中通过直接的化学作用发挥它们的功能，主要有烷化剂，如甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝基乙基脲烷(NEU)、硫酸二乙酯(DES)等，它们含有一个或多个活跃的烷基，能转移到电子密度较高的分子中去，置换其他分子中的氢原子而使碱基改变；核酸碱基类似物，如5-溴尿嘧啶(BU)、5-溴去氧尿核苷(BudR)等，为一类与DNA碱基相类似的化合物，渗入DNA后，可使DNA复制发生配对上的错误；抗生素，如重氮丝氨酸、丝裂毒素C等，具有破坏DNA和核酸的能力，从而可造成染色体断裂。 本实验使用的是紫外线诱变，紫外线诱变处理的有效波长为200-300 nm，最适波长为254nm(此为核酸的最高吸收峰)。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子易形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。需要注意的是诱变要在暗箱中进行，为了防止DNA的光修复作用。经过诱变处理的菌株，还需要进行营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化等步骤才能获得想要的营养缺陷型菌株。本实验使用紫外线来诱发突变，并采用青霉素法淘汰野生型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。材料与方法1、材料（1）实验菌种 E.coil K12 SF+（2）培养基 LB液体培养基：酵母粉0.5克，蛋白胨1.0克，NaCl 1.0克，蒸馏水100毫升，pH7.2LB固体培养基：LB液体培养基100毫升，琼脂粉2.0克2LB液体培养基：酵母粉1.0克，蛋白胨2.0克，NaCl 2.0克，蒸馏水100毫升，pH 7.2基本液体培养基 Vogel 50（即浓缩50倍）：MgSO47H2O 10克，柠檬酸100克，NaNH4HPO44H2O 175克，K2HPO42H2O 599.88克（K2HPO43H2O 656.319克）蒸馏水 600ml。Vogel 50 2毫升，葡萄糖2克，蒸馏水98毫升，琼脂 2克，pH 7.0基本固体培养基 基本液体培养基100毫升，琼脂2克， pH7.0， 无N基本液体培养基 K2HPO4 O.7克（或K2HPO43H2O 0.92克），KH2PO4 0.3克，柠檬酸钠3H2O 0.5克，MgSO47H2O 0.01克，葡萄糖2克，蒸馏水100毫升，pH 7.02N基本液体培养基 K2HPO4 0.7克（或K2HPO43H2O 0.92克），KH2PO4 0.3克，柠檬酸钠3H2O 0.5克，MgSO47H2O 0.01克，（NH4）2SO4 0.2克，葡萄糖2克，蒸馏水100毫升，pH 7.0 （3）试剂和仪器试剂 生理盐水，混合氨基酸，混合维生素仪器 试管、试管架、锥形瓶（500ml、100ml）、酒精灯、接种环、涂布棒、移液枪、1ml枪尖、200l枪尖、牙签、培养皿、5ml离心管、离心机、超净台、恒温摇床、恒温培养箱2、方法（1）紫外诱变接种E.coil K12 SF+于5ml LB液体培养基中，37培养过夜6000rpm，5min，离心收集菌体生理盐水洗涤二次用4ml生理盐水悬浮将7cm的培养皿放到超净台中，紫外照射1min取3ml菌悬液加入培养皿中并轻摇使菌液平铺开，不加盖，放到试管加上，紫外照射2min迅速加入3ml 2LB液体培养基并混匀，盖上皿盖用黑布将培养皿包好，放到37的恒温培养箱中培养12h以上（2）营养缺陷型的检出和划线复证6000rpm，5min，离心收集诱变后的菌体生理盐水洗涤二次用4ml生理盐水悬浮取0.1ml菌悬液至5ml的无N培养基中，37恒温摇床中培养12h按1:1加入5ml 2N基本培养基和终浓度为20g/ml的Amp，37恒温摇床培养从培养12h、16h、24h的菌液中，分别取0.1ml到二个培养皿中向二个培养皿中分别倒入冷却至45-50的基本及完全培养基，混匀平放凝固后放入37的恒温培养箱中培养36-48h后，选出完全培养基上菌落数远大于基本培养基的那一组用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落200个分别点种于基本及完全培养基上，先基本后完全点种完后，置于37的恒温培养箱中培养选取在基本培养基上不生长，完全培养基上生长的菌落，在基本培养基上划线37恒温培养，24h后观察是否生长，不生长则是营养缺陷型（3）生长谱鉴定将营养缺陷型的菌落接种到5ml LB液体培养基中，37培养14-16h6000rpm，5min，离心收集菌体生理盐水洗涤二次用4ml生理盐水悬浮取菌悬液1ml于培养皿中，加入冷却至45-50的基本培养基，混匀平放，待凝，共二皿将皿底分成9格，分别用接种环依次放入混合氨基酸或混合维生素少许，并留一个空白对照(加一滴MgSO4)37培养24h，观察生长情况，据此判断是哪种营养缺陷型实验结果及分析1、 营养缺陷型的检出和划线复证在12h，16h，和24h的基本和完全培养基上都有菌落长出，并且完全培养基上的菌落数都明显多于基本培养基，其中差距最大的为培养16h的。挑取16h的完全培养基上的单菌落以先基本后完全的方式进行点种，获得4个在完全培养基上生长而在基本培养基上不生长的菌落。对这4个可能的营养缺陷型进行划线复证，结果是在基本培养基上均有生长，表明之前的点种检出营养缺陷型操作产生了假阳性反应。推测可能是菌体在基本培养基上生长缓慢，而且点种接种量小，培养时间短，所以形成的菌落很小，加之点种时牙签可能划破了平板表面，从而影响观察并造成误差。从这一步的实验结果来看，诱变失败，没有获得预期的营养缺陷型细菌。接下来的实验使用其它组的复证为营养缺陷型的菌落。2、 营养缺陷型生长谱鉴定营养缺陷型生长谱鉴定的结果是混合氨基酸组和混合维生素组均没有菌落长出，而对照组有菌落长出（故此处不再列出各混合氨基酸组和混合维生素组的具体成分）。基于这个结果，现分析如下：（1）使用的突变株确实为营养缺陷型，否则可以在基本培养基上生长；（2）该突变株可能为二种或多种氨基酸营养缺陷型，并且与所使用的混合氨基酸成分组合不匹配；（3）对照组不应有菌落长出，而产生菌落的原因可能为MgSO4没有灭菌或是使用过程中被杂菌污染。实验中一些注意事项1、 紫外诱变需要避光，以防光修复作用；2、 诱变后加2倍LB培养基培养，可以消除表型延迟；3、无N和2N培养基的使用，是为了浓缩营养缺陷型；4、点种时要先基本后完全，并注意不要划破培养基表面；5、复证是必须的，不可轻视，点种容易出现假阳性反应；6、营养缺陷型鉴定时要使用倾注平板，不能采用涂布的方式；7、生长谱鉴定时，点的氨基酸量不能太多，防止扩散混杂。实验总结和个人体会本次试验前半部分进行的比较顺利，但是未能获得营养缺陷型菌株，使用的其他组的营养缺陷型菌株进行营养缺陷型生长谱鉴定也未能获得预期结果。虽然实验不是很成功，但是学到的知识却是一点也不少。本实验的每一个步骤都值得去深思，考虑它的前因后果；每一个步骤都不是孤立的，都是围绕着更好的获得营养缺陷型展开。实验之前对于一些操作的认识都流于表面或仅限于理论层面，并没有深思为什么要这么做，这么做有什么好处，对于原理方面的解读是一知半解。通过这次试验虽然没有都弄明白，但也学到了很多，可以更好的把学到的微生物知识和实际的工作结合起来，而不是相互孤立的来看。具体的实验过程非常的锻炼人，对于提升实验技能大有帮助