异嗜性抗体对免疫测定干扰的研究进展

分子诊断与治疗杂志2010年1月第2卷第1期J Mol Diagn Ther, January 2010, Vol. 2 No. 1 异嗜性抗体对免疫测定干扰的研究进展 蒋利君黎宇戴盛明* 摘要异嗜性抗体(HA)可以在免疫测定中产生干扰。它具有多特异性结合的特点， 能与多种动物 制备试剂中的抗体结合， 可造成测定的结果呈假阳性或假阴性。本文主要分析HA对免疫测定的干扰机制、 干扰的常见项目及消除HA干扰的方法。 关键词异嗜性抗体； 免疫测定； 多特异性； 干扰 Heterophil antibody interference in immunoassay JIANG Lijun， LI Yu， DAI Shengming* （Department of Laboratory Medicine, The Fourth Hospital Affiliated to Guangxi Medical University, Guangxi， Liuzhou 545005, China） ABSTRACTHeterophil antibody (HA) can generate interference in the immunoassay. It has more specific binding characteristics, with a variety of animals antibody for reagents in immunoassay, then can cause false results. This paper analyzes the interference mechanism of HA, interference test items and how to eliminate HAinterference. KEY WORDSHeterophil antibody； Immunoassay； More specific； Interference 过去， 由于检验人员缺乏对异嗜性抗体 （heterophil antibody， HA） 的认识， 忽视了其对基于抗原抗体免疫测 定法的干扰， 使特异性和准确性得不到良好的保证。随 着免疫学的深入发展， 人们逐渐认识到HA干扰的严重 性。虽然HA对样本的干扰机率很低， 在饲养宠物兔的 人群中有30%40%可检测到HA， 但其中仅有0.05% 0.5%在免疫检测时易受到HA的干扰 1。有案例表明， 在人绒毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotropin， HCG） 测定中， 由于患者血清中HA的存在， 造成HCG假 阳性结果， 被误诊为绒毛膜癌， 使患者遭受无意义的手 术和/或化疗 23。因此， 为防止并减少此类悲剧的发生， 需要科学工作者对HA有充分认识， 寻找有效消除其干 扰的方法。 1HA的特性与干扰机制 1.1概念 HA是由已知的或未知的抗原物质刺激人体产生 的一类具有足够滴度、 能与多个物种的免疫球蛋白发 生相对弱的结合的多重特异性的免疫球蛋白34。 1.2来源 HA的产生通常是由于人类直接接触到动物、 污 染的食品、 未经高温消毒的鲜奶和免疫疗法或者接种 来源于动物血清或组织的疫苗产品后产生。在大多 数情况下， 直接接触宠物小鼠或实验室小鼠是导致人 体产生HA最常见的原因3。研究发现， 存在人体中 的HA包括天然抗体和自身抗体。大多数的HA属于 天然抗体， 为干扰的主要类型5。HA最初在传染性单 核细胞增多症的患者血清中发现。据研究证实， 在健 康人群中， 约3%15%体内含HA2。此外， 在一些获 得性或先天性IgA缺陷综合征的患者血清中也发现 HA的存在6。 1.3特性 HA属人体内源性抗体， 具有相对稳定的化学结 构， 分子量约160kD， 由于其分子量较大， 不易通过肾 小球滤过膜， 因此HA在正常情况下通常存在于血液 中而不会存在尿液中7。HA一般无明确的免疫原， 可 作者单位： 广西医科大学第四附属医院检验科， 广西， 柳州 545005 *通讯作者： 戴盛明， E-mail: daishm 综 述 68 分子诊断与治疗杂志2010年1月第2卷第1期J Mol Diagn Ther, January 2010, Vol. 2 No. 1 与多种动物抗体结合， 具有多重特异性的特点， 但其 亲和力较弱4。研究表明， HA是IgG亚类中较弱的抗 体， 可与许多动物免疫球蛋白的Fc和Fab表位结合， 而不与抗原结合位点结合。根据HA结合动物免疫球 蛋白的部位， 可以将其分为两类， 一类是可以结合山 羊、 老鼠、 大鼠、 马及牛IgG的Fab部位， 另一类是可以 识别老鼠、 马、 牛和兔子的免疫球蛋白的Fc段。不同 物种的Fab片段相似， 所以HA在牛、 羊、 马、 豚鼠、 鼠 和猴免疫球蛋白间存在的交叉反应， 鼠抗体表现得特 别强烈， 而兔抗体与其它物种发生的交叉反应少 见8。有研究发现， HA在糖尿病家族具有保护个体的 作用， 血清HA阳性者患1型糖尿病的机率低于HA阴 性者9。 值得一提的是，HA 容易和人抗动物抗体相混 淆。有文献表明， HA和人抗动物抗体具有一定的同 源性， 均能发生交叉反应， 造成干扰。但是在性质方 面， 它们还存在着许多差异。人抗动物抗体具有高亲 和力， 可定向结合到动物的抗原表位上， 这些特异性 抗体可以通过桥联的方式与其相对应物种的抗体结 合， 从而干扰免疫测定。人抗动物抗体的产生通常有 已知的动物免疫球蛋白治疗史或者接触史， 而HA通 常包含天然抗体和因接触未知的动物蛋白而产生的 自身抗体， 其亲和力往往较弱。 1.4干扰机制 HA的产生机制至今还不能阐明， 目前所使用的免 疫试剂抗体大多源于实验动物， 因此， 体内含HA的患者 在做血清免疫检测时， HA可与试剂抗体结合而导致干 扰。HA通常与试剂抗体的Fc区表位或者F(ab )2区域 的决定簇结合。目前公认的HA在免疫测定中的干扰机 制主要发生在夹心免疫测定法和竞争免疫测定法中。 1.4.1HA在夹心免疫测定法中的干扰机制： ELISA 夹心法测定中， HA与试剂抗体 （捕获抗体和标记抗 体） 的结合， 可通过Fc-Fc和Fab-Fab （见图1） 两种结合 方式干扰测定89。 正常情况下， 在ELISA夹心法中， 待测抗原同时 与捕获抗体和标记抗体结合， 形成了固相捕获抗体- 待测抗原-标记抗体的复合物 （如图1A所示） 。在以 Fc-Fc的方式结合的机制中， HA的Fc端结合到捕获 抗体的Fc段上， 而HA的Fab区域则结合到标记抗体 的Fab区域上， 导致假阳性结果 （如图1B所示） 。在以 Fab-Fab结合方式的机制可引起假阳性或假阴性的结 果， 如HA的Fab区域通过分别结合捕获抗体的Fab区 域和标记抗体的Fab区域， 阻挡捕获抗体和标记抗体 与待测抗原的结合， 从而导致假阴性 （如图1C所示） ； HA的F(ab )2通过同时结合捕获抗体的Fab区域和 标记抗体的Fab区域， 形成固相捕获抗体-HA-标记抗 体复合物， 如果标本中无待测抗原， HA就引起假阳性 的结果 （如图1D所示） 。 1.4.2HA在竞争免疫测定法中的干扰机制： 在免疫 竞争法测定中， HA干扰也可造成假阳性或假阴性10 (如图2所示)。 在正常的竞争性免疫反应中， 待测抗原与标记抗原 竞争的结合到连接在载体上的捕获抗体， 形成正常的反 应复合物 （如图2B所示 ） 。但是如果反应体系中存在HA， 测定结果将可能出现假阳性或假阴性的现象。 造成假阴性结果的机制： HA通过同时结合捕获 抗体和标记抗原， 形成异常的反应复合物(如图2C所 示)， 干扰捕获抗体结合检测抗原， 消耗可结合待测抗 原的捕获抗体， 从而导致假阴性。造成假阳性结果的 机制： HA直接结合捕获抗体与抗原结合的部位， 形成 图1夹心免疫分析法 Figure 1Normal mechanism (A) and possible means (B,C) of HAinterference 图2竞争免疫分析法 Figure 2Schematic depiction of HAinterference in competitive immunoassay 69 分子诊断与治疗杂志2010年1月第2卷第1期J Mol Diagn Ther, January 2010, Vol. 2 No. 1 异常的复合物(如图2D所示)， 占据捕获抗体结合待测 抗原或标记抗原的结合空间， 消耗可结合待测抗原或 标记抗原的捕获抗体， 导致假阳性。 1.4.33-位点免疫检测法中的干扰机制： 该干扰存在于 肌钙蛋白I的免疫检测中。所谓的3-位点是试剂盒中含 有针对肌钙蛋白I分子上3个不同抗原决定簇的3种抗 体， 肌钙蛋白I可以同时结合2个捕获抗体与1个示踪抗 体或者1个捕获抗体与2个示踪抗体， 使特异性和灵敏 度大大提高， 后者可使反应的灵敏度进一步增高11。由 于肌钙蛋白I 3-位点免疫测定增加了一种捕获抗体或者 标记抗体， 这也同时提高了捕获抗体或者标记抗体与HA 结合的机率， 从而导致肌钙蛋白I 3-位点免疫测定比肌 钙蛋白I双位点免疫测定更加容易受到HA的干扰， 结 合的部位与上述两种机制相似。 2受HA干扰的常见检测项目 HA在免疫实验测定中对项目的干扰较广， 但机 率较低， 现举例分述如下。 2.1对内分泌的检测 在对内分泌的检测项目中， 如在皮质醇的检测 （罗氏模块E170竞争免疫分析） 中， HA的干扰是由于 它的F （ab ） 2片段与捕获抗体的F （ab ） 2片段有相应 的结合位点而结合， 并且抑制待测皮质醇或者标记皮 质醇与捕获抗体的结合， 从而导致该免疫测定出现假 阳性。或者HA通过桥联捕获抗体和标记皮质醇， 导 致该免疫测定出现假阴性10。又如我们在使用免疫 放射法(IRMA)和化学发光法(CLIA)对胰岛素样生长 因子-1(IGF-1)检测时发现， HA的干扰可造成IGF-1的 测定呈假阴性的结果。实验证明， 用HA阻断试管处 理后， IGF-1的测定结果与临床表现相符12。还有对 于患有结节性甲状腺疾病的患者， 在做降钙素(CT)测 定时， 由于受到HA的干扰， 致使造成假阳性的结果， 最终导致患者被误诊为甲状腺髓样癌等13。 2.2对肿瘤标志物测定 对于CEA的免疫分析， Oslo中心实验室Bjirner 等14曾报道， HA对CEA测定的干扰引起假阳性和假 阴性结果的机率是4。用Medics检测PSA时， HA 通过结合鼠源性单克隆抗体 （PSA捕获抗体试剂） 与 标记的小鼠单克隆抗-PSA检测抗体， 从而导致PSA 假阳性结果15。 2.3对心脏标志物的免疫测定 在肌钙蛋白T第三代CARDIAC T 检测法中发现 存在HA干扰16。实验证明， 用患者的血清与正常小 鼠血清孵育 （室温1 h） ， 然后用CARDIC T 法测量的 心肌肌钙蛋白T， 可明显消除HA的干扰。HA的干扰 主要是通过在捕获抗体和标记抗体之间形成桥梁以 干扰夹心法的测定， 从而导致肌钙蛋白T假阳性。 2.4对病毒相关抗原抗体检测 近年来研究人员发现17， 在使用胶体金法快速检 测HIV时， HA的干扰可造成HIV的测定呈假阳性的 结果， 实验证明， 用HA阻断试管处理样本后， 重新对 样本进行测定， 结果为阴性。另外， 对于这些疑为有 HA干扰的样本， 我们可以利用过去使用的快速凝集 试验检测样本中是否有HA的存在。一般情况下， 在 对患有传染性单核细胞增多症的患者血清检测HA 时， 结果显示出有很高的特异性。但偶尔会在以下情 况检测HA时出现假阳性结果， 如白血病、 麻疹、 疟疾、 系统性红斑狼疮、 胰腺癌、 病毒性肝炎以及人类免疫 缺陷病毒感染。例如， 急性戊型肝炎患者用快速凝集 法检测HA会出现假阳性结果18。 2.5对细胞因子 （如IL-2、 TNF、 IFN） 检测的干扰 用ELISA夹心法对干扰素-进行检测 （所用的试 剂为羊抗人干扰素-多克隆抗体和生物素标记的鼠 抗人干扰素-单克隆抗体） ， HA通过桥联鼠抗人干扰 素-单克隆抗体和羊抗人干扰素-多克隆抗体从而出 现假阳性的结果， 在反应体系中添加5 的小鼠血清 可有效地吸附HA19。 2.6治疗药物监测 针对一些有免疫测定干扰史的患者， 在其进行肝 移植手术后， 对其血药浓度他克莫司的测定发现存在 假阳性的现象， 可能为HA干扰的结果20。 2.7其它 对于一些不常见的项目， 如嗜铬粒蛋白A、 类胰蛋 白酶、 泌乳刺激素等这些项目受到HA的干扰的报道， 在 过去的10年里已经出现过。这里就不再一一举例说明。 3HA干扰的消除措施 由于标本中HA的来源是未知的， 不能够准确的 针对HA的结合位点进行操作， 目前尚未有一个完全 消除HA干扰的方法。以下就现有的消除HA的方法 进行分述。 3.1稀释法 如果样本HA浓度含量不是很高， 且它所造成的 干扰不是很大时， 稀释法是可以减少它的干扰， 但不 70 分子诊断与治疗杂志2010年1月第2卷第1期J Mol Diagn Ther, January 2010, Vol. 2 No. 1 能完全消除。据报道， 稀释法对使用 AxSYM 测定 HCG中受到HA的干扰具有很好的消除作用， 因为在 它的稀释液中已经含有一定量低浓度的动物蛋白来 吸附HA21。在对其样本稀释后， 降低了HA的浓度， 在低浓度动物蛋白来吸附HA后， 原有的干扰强度可 明显减小。 3.2使用异嗜性抗体阻滞剂、 阻断试剂盒或阻断试管 目前市场上已经有商品化的阻断剂如： IIR、 NS-ABT、 HBR、 Heteroblock、 MAB33及poly MAB33。将它们加入待测的样品中， 利用非特异性 和特异性阻断剂与HA结合从而达到减少干扰的目 的。消除干扰的效果通常由干扰物的浓度、 类别或亚 类， 以及阻断剂的类别和分型所决定。如， 奥林巴斯 公司在对铁蛋白检测时， 用F(ab )2相关试剂提前处 理待测样本可在一定程度上消除HA的干扰22。 异嗜性阻断试剂盒现在已广泛使用。其内部特 制的免疫球蛋白， 可用于中和免疫测定法中产生干扰 的HA。HA阻断试剂对预防假阳性的HCG结果有很 好的效果， 但添加鼠免疫球蛋白对预防假阳性的HCG 结果无影响。 又如使用HA阻断试管。使用贝克曼化学发光免疫 法测定检测如游离PSA特异性抗原等项目时， 样本在检 测前用HBT处理， 大大减少了假阳性的发生率23。 3.3提取法 可以采用吸附在氟乙烯表面的鼠McAb， 固相结 合在琼脂糖凝胶柱上的蛋白G或者蛋白A去提取HA 的方法、 三氟乙酸沉淀法、 巯基试剂法、 阳离子交换剂 和亲和层析等方法， 均对消除HA有一定效果。但不 宜使用热或酸处理来灭活血清中的HA， 因为大多数 的分析物都不稳定 24。 3.4利用活体生物素单链抗体作为捕获试剂 使用活体生物素单链抗体作为捕获抗体用于固相 抗原的测定技术可以在一定程度上有效地避开HA的干 扰25。将活体生物素单链抗体作为捕获抗体结合到固 相的抗原上， 再加入已经用标记的亲和素结合到生物素 上， 形成固相抗原-活体生物素单链抗体-标记亲和素复 合物， 由于生物素与亲和素的结合为高度特异的结合， 故可较有效地避开HA的干扰。此外， 在活体生物素单 链抗体与固相抗原发生特异性的反应结合过程中， 即使 样本里存在有HA， 它以Fab-Fab的结合模式结合到过剩 的生物素单链抗体试剂上， 最终也只能被冲洗清除， 从 而使测定在一定程度上避开HA的干扰。 3.5其它 另外还有多种方法被探讨， 如在激素类的测定中使 用无免疫球蛋白的标本来测定， 这是避免HA干扰的理 想的方法， 但目前还不切实际26； 使用两步法的免疫分 析， 增加洗涤步骤， 把亲和力弱的HA洗脱掉， 可减少HA 的干扰； 通过其他的检测方法重新检测样本， 避开HA的 干扰， 如对HBV的测定使用双标记时间分辨免疫荧光 分析法来检测27； 或使用多元化的免疫检测系统， 可以 发现HA及其造成的干扰， 得到较为可信的结果。 4展望 HA的干扰可能伴随在每一个检测项目中， 这就 促使我们需要寻找一个有效的方法来消除它。尽管 目前科学技术有了很大的进步和人们对其干扰机制 有了深入的了解， 但是到目前为止还没有一个单一的 技术方法可以彻底地消除HA的干扰。目前我们所使 用的消除方法大致为上述的几种， 它们各有自己的优 缺点， 每种消除方法的效果取决于免疫分析法和样本 中HA的性质。在探索寻求彻底消除HA干扰的方法 的过程中， 不仅要对HA的特性及干扰机制了解透彻， 更重要的是要认识到HA干扰的潜在性及其检测程 序， 以确定它们在哪些情况下可能会出现干扰。这 样， 就可以有针对性地找到消除干扰的方法。当然， 最重要的还是检验结果的最后审核。目前临床诊断 越来越依赖实验室检验结果， 为确保患者能得到准确 的诊断治疗， 当发现患者的临床表现和实验室数据不 一致时， 临床医师应立即与实验室进行沟通与交流。 参考文献 1Park A, Edwards M, Donaldson M, et al. Lesson of the week: interfering antibodies affecting immunoassays in woman with pet rabbitsJ. BMJ, 2003， 326(7388):541-542. 2Olsen T G, Hubert P R, Nycum L R. Falsely elevated human chorionic gonadotropin leading to unnecessary therapyJ. Obstet Gynecol, 2001， 98 （5 pt 1） : 843-845. 3Rotmensch S, Cole L A. False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in women with fale positive human chorionic gonadotropin concentrationsJ. Lancet, 2000, 355 （9205） : 712-715. 4Jahagirdar V R, Strouhal P, Holder G, et al. Thyrotoxicosis factitiamasqueradingasrecurrentGraves disease: endogenousantibodyimmunoassayinterference,fale 71 分子诊断与治疗杂志2010年1月第2卷第1期J Mol Diagn Ther, January 2010, Vol. 2 No. 1 positive a pitfall for the unwaryJ. Ann Clin Biochem, 2008， 45: 325-327. 5Levinson S S, Miller J J. Towards a better understanding of heterophile (and the like) antibody interference with modern immunoassaysJ. Clin ChimActa, 2002, 325 (1-2): 1-15. 6KnightAK, BingemannT, Cole L, et al. Frequent false positive beta human chorionic gonadotropin tests in immunoglobulin a deficiencyJ. Clin Exp Immunol, 2005， 141(2): 333-337. 7Braunstein G D. False-positive serum human chorionic gonadotropinresults:causes,characteristics,and recognitionJ.Am J Obstet Gynecol, 2002， 187 （1） :217-224. 8Segal D G, DiMeglio L A, Ryder K W, et al. Assay interference leading to misdiagnosis of central precocious pubertyJ. Endocrine, 2003, 20(3):195-199. 9She J X, Ellis T M, Wilson S B, et al. Heterophile antibodies segregate in families and are associated with protection from type 1 diabetesJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1999， 96 (14):8116-8119. 10 Bolland M J, Chiu W W, Davidson J S, et al. Heterophile antibodiesmaycausefalselyloweredserumcotisol valusesJ. J Endocrinol Invest, 2005, 28(7): 643-645. 11 Zhu Y, Jenkins M M, Brass D A, et al.Heterophilic antibody interference in an ultra-sensitive 3-site sandwich troponin I immunassayJ. Clin ChimActa, 2008， 395 （1-2） :181-182. 12 Brugts M, Luermans J, Lentjes E, et al. Heterophilic antibodies may be a cause of falsely low total IGF-I levelsJ. Eur J Endocrinol, 2009, 16. Epub ahead of print 13 Papapetrou P D, Polymeris A, Karga H, et al. Heterophilic antibodies causing falsely high serum calcitonin valuesJ. J Endocrinol Invest, 2006, 29(10): 919-923. 14 Bjerner J, Nustad K, Norum L F, et al. Immunometric assay interference: incidence and preventionJ. Clin Chem, 2002, 48(4):613-621. 15 Fritz B E, Hauke R J, Stickle D F. New onset of heterophilic antibody interference in prostate-specific antigen measurement occurringduringtheperiodofpost-prostatectomy prostate-specific antigen monitoringJ. Ann Clin Biochem, 2009, 46(Pt 3): 253-256. 16 WhiteGH,TidemanPA.Heterophilicantibody interference with CARDIAC T quantitative rapid assayJ. Clin Chem, 2002, 48(1): 201-203. 17 Spencer D V, Nolte F S, Zhu Y. Heterophilic antibody interferencecausingfalse-positiverapidhuman immunodeficiency virus antibody testingJ. Clin ChimActa, 2009, 399(1-2): 121-122. 18 Fisher B A, Bhalara S. False-positive result provided by rapid heterophile antibody testina case of acute infection with hepatitis E virusJ. J Clin Microbiol, 2004， 42(9):4411. 19 Aly T, Devendra D, Barker J, et al. Heterophile antibodies masquerade as interferon-alpha in subjects with new-onset type 1 diabetesJ. Diabetes Care, 2004, 27(5):1205-1206. 20 Hermida J, Tutor J C. Falsely increased blood tacrolimus concentrations using the ACMIA assay due to circulating endogenous antibodies in a liver transplant recipient: a tentative approach to obtaining reliable resultsJ.Ther Drug Monit, 2009, 31(2):269-272. 21 Jones G R, Giannopoulos P. A method for routine detection of eterophile antibody interference in the Abbott. AxSYM hCG assayJ. Pat