微流控芯片应用进展

微流控芯片应用进展 高丽娜丁惠徐建栋吕雪飞邓玉林 * 陈辉高丹丹 ( 北京理工大学生命学院北京100081) 高丽娜女， 24 岁， 硕士生。从事微流控芯片研究。* 联系人， E-mail: deng bit. edu. cn 国家自然科学基金项目 ( 20905007) 和教育部新世纪优秀人才支持计划项目( NCET- 08- 0048) 资助 2010- 03- 31 收稿， 2010- 06- 07 接受 摘要微机械加工技术的发展促进了微全分析系统( TAS) 的广泛发展。芯片实验室具有多种单元 技术灵活组合和大规模集成的特点， 并且反应时间快， 样品消耗小， 反应速率高， 从而广泛应用于各个研究领 域。本文将主要从微流控芯片在蛋白质、 核酸、 细胞培养、 临床诊断等方面的应用进行综述。 关键词微全分析系统微流控芯片实验室 Progress of Application of Microfluidic Chip Gao Lina，Ding Hui，Xu Jiandong，Lv Xuefei，Deng Yulin*，Chen Hui，Gao Dandan ( School of Life Science，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081) AbstractWithprogressesof micromachiningandmicrosystem， kindsofavailablemicro-manufacture technologies were developed and improved，which promoted the abroad progress of micro total analysis system ( TAS) . Lab on a chip is a flexible combination and mass integration of a number of units. It takes less time and requires fewer samples，and is applied widely in various research areas. This paper is intended as an introduction and early compendium for the application of TAS. KeywordsTAS;Microfluidic chip;Lab-on-a-Chip 随着微电子加工工艺的快速发展， 化学家、 物理学家、 生物学家以及工程师们正不断努力将常规的 实验装置、 实验技术以及实验过程微型化。微全分析系统( -TAS) 或称芯片实验室( Lab-on-a-Chip) 应 运而生。 -TAS 之所以受到人们的广泛关注， 与其自身特点是密不可分的。首先从概念可以将其理解为将 一个全分析型的实验室微型化到一个芯片， 完成样品预处理、 反应、 注射、 分离和检测等分析步骤; 它可 以以流体和阵列的形式缩短分析时间， 与许多样品处理过程耦合; 在低样品量、 低试剂消耗的状态下提 供一个平台进行分析、 生物、 物理和化学等反应步骤。-TAS 具有分析快速、 信息量巨大、 制作成本低 廉、 样品与试剂消耗少等固有特性; 同时也具有一些内在潜质如自动化、 全分析系统集成; 在使用操作上 打破了传统实验所需要的各种束缚， 如专门的实验环境、 实验装置、 经过培训的专业操作人员， 在没有上 述条件下即使一个非专业人员也能对 -TAS 操作， 实现了操作的简单易行。 芯片实验室目前已在， 比如， 生物化学领域( DNA 序列、 蛋白组学) 1、 药学领域( 组合文库、 药物发 现) 2、 化学合成领域( 反应控制) 3、 环境检测 4及临床诊断学 5等方面得到广泛应用。本文将主要 从微流控芯片在蛋白质、 细胞培养、 临床诊断、 环境监测等方面的应用进行综述。 1微流控芯片在蛋白质相关研究中的应用 1. 1微流控芯片用于蛋白质的富集纯化 蛋白质组学的兴起使得蛋白质的富集纯化方法成为研究焦点， 这主要是因为蛋白质不能像 DNA 那 样通过扩增得到富集。为了下游分析获得准确可信的结果， 各种富集纯化方法在蛋白质分析中具有重 298化学通报2010 年 第 10 期http: / /www. hxtb. org 要意义， 尤其对于复杂蛋白质混合物中的低丰度蛋白。然而传统的分析纯化方法步骤繁琐、 样品损耗 大， 不利于稀有样品的分析测定， 因此发展快速高通量的分析方法十分必要。-TAS 自身特点满足了上 述要求， 研究者们不断将各种制备方法微型化， 并转移到芯片上， 为微量样品的富集纯化提供了有效 手段。 等速电泳( ITP) 是一种优良的样品预浓缩方法。Mohamadi 等 6在一个以聚甲基丙烯酸甲酯 ( PMMA) 为基质的十字微流控芯片上， 通过瞬时等速电泳实现了人血浆白蛋白和其单克隆抗体的免疫 复合物的在线预浓缩， 信号放大了 800 倍， 从而提供了一种可以在标准十字通道内实现在线预浓缩和堆 积的新方法。在预浓缩后进行非变性凝胶分离， 是一种新型的二维分析方法。Kelly 等 7利用离子渗透 膜实现了高于 10000 倍的蛋白预浓缩。利用染料模型分析物， Jung 等 8通过对电渗流( EOF) 抑制和前 导尾随离子浓度的调节， 将短暂的 ITP 用于获得百万倍的样品堆积富集。Kim 等 9在镜面方向两个 V 型聚二甲基硅烷 PDMS 微通道间施加电场， 在阳极处获得 103 106倍浓度的负电荷蛋白。Dodge 等 10 将含电泳分离、 选择、 酶切的程序转移到微流控系统中， 用于与质谱联用时数十 nL 的蛋白样品制备。 Liu 等 11利用植入胰蛋白酶的溶胶凝胶实现了在几秒内进行有效、 低量( 16fmol) 的蛋白酶解。数字化 EWOD 微流控操作也能为蛋白制备服务， Moon 等 12将该法用于蛋白生物学样品液滴的生成， 淋洗液液 滴和试剂液滴紧随平行在线纯化和示数之后， 用于基质辅助激光解析电离质谱( MALDI-MS) 研究。 1. 2微流控芯片用于蛋白质的分离 微流控技术也非常适用于蛋白质组学的研究。Kohlheyer 等 13， 14提出了一种使用光聚合丙烯酰胺 膜的微型化自由流电泳芯片。通过对该芯片的改进， 在电场作用下形成一个 pH 2. 5 11. 5 范围的线性 pH 梯度， 对等电点 pI 3 10 范围的等电聚焦标记物( marker) 进行了分离， 结果如图 1 所示。在该芯片 中实现人血清白蛋白 HAS 聚焦， 对大分子量的化合物也能获得较窄的峰。该研究提供了一种可以连续 进样进行分离纯化的微装置元件。 图 17 种荧光等电聚焦标记物自由流等电聚焦电泳图 Fig. 1Free- flow isoelectric focusing of 7 fluorescent IEF markers 7 种等电点分别为 pH 4. 0、 5. 1、 6. 2、 7. 2、 8. 1、 9. 0、 10. 3 的标记物在 150V 电压、 分离时间 2s 内被完全分离 对于多组分样品的分离分析， 从一开始就位于 - TAS 领域的研究中心。科学家们不断地将各种分离分 析方法微型化， 制作出各种分离元件。将填充柱毛细管 电泳转移至芯片， 存在着巨大挑战。填料的均匀、 稳定 是实验的关键。Weng 等 15利用溶剂挥干的方法， 将牛 血清白蛋白的单壁碳纳米管， 固定到 PMMA 微流控芯片 通道内。在 32mm 长的分离通道内， 用 70s 的时间完成 了色氨酸对映体的手性分离， 分离度达到 1. 35。该研究 为芯片上手性分离提供了一种新方法和一种新型的亲 水性蛋白手性填料。 Emrich 等 16研制出一个微流控分离系统完成二维 凝胶电泳对复杂蛋白化合物的分离。该系统巧妙地通过一个微流控界面将等电聚焦路径与 20 个正交 通道连接， 实现了芯片上蛋白质二维凝胶电泳， 非常适用于蛋白质组学研究中庞大信息量的要求。图 2 为其设计图。 在微流控功能元件集成的过程中， 有些新的分析方法应运而生。Shackman 等 17提出一种新型的 电泳方法， 称为移动界面电泳梯度洗脱， 并制作了一个低成本的含有 8 条通道的聚合物微流控装置， 用 于小分子染料、 DNA、 氨基酸分子和免疫产物的 GEMBE 分离， 其装置及方案如图 3 所示。 1. 3微流控芯片用于蛋白质结晶 传统的化学反应条件的摸索与优化是一个繁琐的过程， 需要消耗大量人力物力， 同时产生大量废弃 物。在效率和环境保护尤为重要的今天， 这种研究方法逐渐被淘汰。TAS 为高通量化学作用提供了 平台。该研究提出了一个 nL 级分配的阵列平台并将其应用于蛋白结晶条件的筛选 18。图 4 为方法示 意图以及实验结果照片， 该平台为酶分析、 蛋白结晶、 细胞分析和组合化学提供了一种研究方案。 Shim 等 19提出了另一个仅需 10g 物质就可筛分 1000 种条件的高通量系统， 该系统用表面张力 398http: / /www. hxtb. org化学通报2010 年 第 10 期 图 2微- DIGE 蛋白分析器设计图 16 Fig. 2Design of the micro- DIGE protein analyzer 16 ( A) 整体设计包括一个弧形 3. 75cm 长的用于一维等电聚焦的横向通道， 与 20 个 6. 8cm 长的纵向通道垂直， 该通道穿过聚焦的蛋白 使其进入二维电泳。( B) 二维分离通道通过更小的通道形成一个微流控界面( MFI) 将两者连接， 通过流体作用将二维分离物 分离， 在电子显微照片中能看清楚 C 和 D。MFI 通道宽 25m、 长 400m、 刻蚀深度 4m 图 3用于 GEMBE 的毛细管与微流控装置 17 Fig. 3Capillary and microfluidic instruments for performing GEMBE 17 引导每个 nL 级液滴到储存微腔室中， 用于晶体成核和生长的透析介入控制。Hansen 等 20则发展了可 变长度的混合反应器， 结合用于蛋白结晶优化的脱水控制。用原位 X 射线对结晶进行衍射分析， 产生 1. 25 的数据分辨的结构。 2微流控芯片在核酸研究中的应用 2. 1微流控芯片用于核酸序列测定 PCR 热循环的微反应器是微型化仪器中研究的热点。对于远程遥控加热， Sklavounos 等 21利用低 千兆赫的微波源与一个微型传输线进行微波能量的局部传送， 实现了 40 /s 速度加热以及 65 /s 速 度有效冷却。Sun 等 22用铁磁流体泵系统将样品在一个环状通道内流过不同温度的区带， 并将此作为 温度反应器的替代。在蛇形微通道内， 连续流体 PCR 的小体积试剂会暴露大的表面， 从而出现试剂损 失并产生反应抑制现象。为此， Kim 等 23将 PDMS 微通道用 2. 5% 聚乙烯吡咯烷酮( PVP) 进行衍生， 改 善了 PCR 效率。对于高灵敏的 PCR， 玻璃表面能用二氯二甲基硅烷修饰， 结合一些反应混合添加剂用 498化学通报2010 年 第 10 期http: / /www. hxtb. org 图 4( a) 为蛋白结晶条件筛选示意图， 将两个微阱片内的蛋白溶液和沉淀剂混合实现蛋白结晶。( b- e) 为微阱内最佳沉淀剂条件 下的蛋白结晶偏振光显微图 Fig. 4( a)Schematic illustration of screening the conditions of protein crystallization by mixing protein solution and precipitants from two microwell patches. ( b- e)Polarized light micrographs of the protein crystals grown in the microwells with the optimal precipitant 于动态钝化。Chen 等 24用这种低表面积对体积比率的双向微流控 PCR 系统方法， 从人基因组样品中 获得 24 个基因的检测。除水平放大外， Wang 等 25将螺形连续流微反应器用于 PCR 介导的 Sanger 循 环测序。 虚拟壁、 油液滴、 化学作用也被应用于转移介导的热循环中。Hsieh 等 26用薄膜铂加热器上的磁活 化进行碎片放大。Neuzil 等 27提出了用于固定液滴的热循环微装置。随着 T 接口剪切的进一步使用， Beer 等 28将液滴小型化至 pL 的体积， 用于单拷贝 PCR。Mohr 等 29在基于连续流体液滴基础上的 PCR 研究表明， 流体速率可显著影响载体流内的热场。 研究者对于平行高通量放大系统也有着极大兴趣。为了应对该挑战， Marcus 等 30将高密度弹性阀 应用于 72 个平行的 450pL RT-PCRs 中。Ottesen 等 31进一步发展了一个有 12 个面板、 每个面板包括 1176 个腔室的平台， 用于复杂肠微生物群生态系统的多基因分析。Marcy 等 32， 33通过另一个高通量系 统实现了人口腔的单个未培养的 TM7 细胞的基因分析， 以及单个造血干细胞的转录因子分析。 PCR 易于和其它的分子生物学形式互补， 从而提高灵敏并改善序列歧视。Hashimoto 等 34通过芯 片上的后 PCR 检测反应以识别低拷贝数的点变化。同样， RT-PCR 与电泳产物筛分过程实现了整合。 Toriello 等 35使用这样一个系统在 380nL 反应中获得 amol( 10 18 mol) 的灵敏度 ( 11RNA 模板) 。 Bontoux 等 36发展了另一个系统， 将单细胞捕捉和分解以及 RT-PCR 进行合并用于整个转录组分析。 除放大功能之外， 微流控能与编码微珠结合产生流动杂交平台用于多样化序列分析 37， 38。Estevez 等 39通过动态寡核苷酸杂交作用的一维傅立叶变换分析， 能够确定核酸的序列和点突变。Pennathur 等 40研究了纳米通道尺寸对 DNA 电泳的影响。 在基因分析中， 大的 DNA 片段分离非常有必要。Fu 等 41通过周期动力学混合用于电泳片段分离 之后的 -DNA 的快速限制酶( EcoRI) 消化。Yasui 等 42用一个 500nm 空间的四方形纳米小柱的阵列在 旋转半径不同的基础上， 将不同的含有千个碱基的 DNA 片段快速分离。另外 Zeng 等 43将一个 SiO 2纳 米颗粒的自组装周期阵列作为筛分基质， 用于 50bp 到 50kbp 的 dsDNA 片段的分离。不同 DNA 大分子 结构有着不同数目的表面接触。在电泳中， Li 等 44利用金纳米点作为局部定位点， 对线性的、 松散的超 螺旋结构以及不同分子量的分子进行分离。 2. 2微流控芯片用于 DNA 生物物理学研究 DNA 条带的物理机械行为是非常有趣的。Benninger 等 45用一个 colaminar 流体系统， 通过定量荧 光成像观察 DNA-染料相互作用的扩散动力学。为了获得 DNA 与 G4 聚合物的压缩变化观察， Pfohl 等 46， 47使用了流体聚焦。通过 X 射线微衍射观察到中间相的高水平垂直排序， 并在浓缩过程中通过 Raman 光谱确定分子相互作用。在一个类似方法中， Larson 等 48用混合的剪切和伸长力， 通过渐进变 窄的微通道用于 DNA 聚合物延伸。用一个高通量( 2400 个腔室) 的微流控平台机械诱导相互作用的分 子捕获， Maerkl 等 49将用于真核转录因子的 DNA 结合图像特征化。 598http: / /www. hxtb. org化学通报2010 年 第 10 期 微尺度单元中的流体易于实现 DNA 穿过纳米尺寸区域的障碍转移。Chansin 等 50通过电场中的 纳米孔观察单分子 DNA 易位。Balducci 等 51， 52通过纳米流体通道实现了 DNA 分子的定向和拉伸， 并 观察到扩散过程中流体相互作用的筛分。Kumemura 等 53演示了在电极间 DEP 介入的 噬菌体 DNA 延伸， 生产长度达 10m。另外 Dukkipati 等 54通过蛋白将 DNA 固定到一个表面并用毛细管流体拉伸。 3微流控芯片在细胞培养中的应用 通过氧敏感染料钌三( 2， 2- 联吡啶) 二氯六水合物的荧光寿命成像， Sud 等 55已经对因细胞吸收 和材料通透性引起短暂的空间氧气浓度变化做出评价。另外， 通过穿过围绕微流控培养室的 PDMS 膜 的扫描电化学显微法能确定氧的消耗， 使用该法测得一个大肠杆菌的呼吸率在 4. 3 10 20 mol/s 左 右 56。为了克服培养过程中 PDMS 装置中的蒸汽诱导渗透转移， Heo 等 57研制出一个 PDMS-聚对二甲 苯-PDMS 混合装置， 循环使用使小鼠胚胎成熟进入囊泡。细胞群也能与材料一起被植入用于进行细胞 培养， 利用一种人造的 3-D 胶样胞外基质笼封接细胞与微流控一起灌流， 可用于细胞的长期培养( 2 周) 58。Choi 等 59用藻酸钙水凝胶作为组织支架并提供微流控路径用于生化环境的暂时性微米尺度 空间控制。 4微流控芯片在微流体混合中的应用 流体在微环境中表现出与宏观截然不同的性质。以雷诺数为例， 它是表征流体流动特性的一个重 要参数， 是流体流动时的惯性力与粘性力之比。低雷诺数条件是微流控系统的特点之一。它意味着流 体流动时各质点间的粘性力占主要地位， 流体各质点平行于管路内壁有规则地流动， 呈层流流动状态。 因此， 在微环境中流体的有效混合成为一个重要的问题， 利用该特点提出了各种混合器。微量混合策略 需要拉伸折叠材料的线性用于反应物均化作用以加快化学过程。在微通道界面区域， Hertzog 等 60利 用收缩的通道进行快速混合( 4s) 。另外， Stoeber 等 61将活化的普朗尼克( pluronic) 凝胶用于周期性 流体偏离。Nguyen 等 62用低频率流体开关产生一个分段流， 通过 Taylor-Aris 分散混合。Sasaki 等 63 利用曲折电极驱动交替电流， 对电渗流进行调节从而影响快速混合。Wang 等 64在非接触丙烯酰胺电 渗过程中， 通过不均一的滑动速率产生混合涡流。Bottausci 等 65将垂直于主通道的次级通道作为交替 流体活塞， 以实现在约 200m 长度上的超快速( 10ms) 混合。利用类似原理， 位于连接通道圈内的铁 磁流体 66或电流变流体控制阀 67也可用于产生流体活塞。依靠空气作用可驱使侧壁偏离并阻塞通 道 68， 或穿过部分环形通道的膜偏离序列均可用于有效的混合( 约 96% ) 69。Hellman 等 70利用 ns 激 光脉冲具有巨大空间和短暂溶解度的特性， 将其用于快速气泡膨胀和破裂， 从而达到 ms 内诱导孔穴混 合的效果。采用一个拟生态方法， Khatavkar 等 71探索了用于微混合的人造纤毛的阵列。对大肠杆菌 进行实验研究 72， 用化学吸引物或化学排斥物控制它们的鞭毛驱动运动， 并由此扰乱化学物质分配。 5微流控芯片在临床诊断中的应用 5. 1微流控芯片用于基于抗体的诊断 临床免疫检验技术对于人类健康有着重要意义。由于传统的检验技术繁琐、 费时且低效， 于是在此 基础上发展出了一种简单方便的免疫测定技术即酶联免疫吸附实验( ELISA) ， 可应用于各种生物活性 物质及标志物的快速临床检测。该方法已成为医学诊断、 环境分析和食品安全等领域的常用分析手段， 不过它仍然存在着试剂消耗量大、 产生废液多、 孵化周期长的缺点。根据 ELISA 的基本原理， 可通过将 其转移到微流控系统中来克服自身方法的缺陷， 从而在很大程度上提高了信息的输出量。 Herrmann 等 73提出了一种微流控装置， 在停流条件下实现了平行 ELISA 实验。PDMS 装置中包含 的磁珠既能作为固相抗体支持物又能作为微混合元件， 用于快速生成活性免疫复合物。Ziegler 等 74发 展了一个 C 反应蛋白表面免疫测定， 用微结构床来控制微毛细管样品流。Matsui 等 75提出了利用微制 作膜的垂直流 ELISA， 并将此用于壬基苯酚的检测。Lehmann 等 76用 2-D 磁驱动的液滴， 在可润湿的图 形路线过程中采用心型( 见图 5) ， 可同时实现多步 ELISA 反应。 698化学通报2010 年 第 10 期http: / /www. hxtb. org 图 5一个液滴连续操作线路图 76 Fig. 5 Sequence of a droplet manipulation cycle 76 5. 2微流控芯片用于生物液体的分析 微流控血液分析方法能用于确定检测健康状况的各种参数。为了血型相配， Kim 等 77提出了一种 一次性自动化微流控模式， 可代替传统凝集试验用于不敏感血型的确定。Cheng 等 78发展了一个快速 廉价的装置， 通过细胞亲和色谱进行 CD4 + T 淋巴细胞计数， 用于 HIV 感染阶段的评价。 血清酶亚型水平能被用于评价肝和心脏疾病的状况。Zhuang 等 79提出了一种温控型电泳芯片用 于乳酸脱氢酶亚型分离及在线生物活性试验衡量产物转变。对于尿内葡萄糖和蛋白的低成本廉价检 测， Martinez 等 80发展了一种 SU- 8 基础的纸图案法。抗凝血剂的正确剂量也非常重要， Song 等 81发展 了一种微流控滴定法以确定抗凝剂 Argatroban 的响应凝血时间。 5. 3微流控芯片用于癌症诊断 癌症已成为威胁人类健康的第一杀手， 按目前的医疗水平， 早期癌症病人约有 80% 90% 以上可 以治愈， 因此早期诊断对癌症患者而言具有重要意义。几种生物标记物和参数能被用于诊断和检测癌 症， 而结合低成本微流控芯片的诊断平台能快速、 敏感、 准确的进行基因分析， 从而促进定制适合各种类 型癌症的治疗方法。VanDijken 等 82提出了一个廉价的多功能装置， 将微流控 PCR/RT-PCR 与 CE 整 合用于免疫球蛋白重链易位和重排检测， 用于多重骨髓瘤癌症的诊断。 蛋白表达和抗原基础的诊断也是癌症诊断的有效方法之一。Fitzpatrick 等 83用一个微流控平台进 行单细胞传代延迟， 用一个高亲和性的配体衍生表面， 通过 MCF- 7 肿瘤细胞显示整联蛋白 5 表面蛋 白， 提供了一种分析单细胞表达谱方法。Nagrath 等 84利用涂布微柱方法， 对 7 /7 早期癌症患者中的少 量游离肿瘤细胞进行了高效的分离和识别。 参考文献 1 W Hancock，A Apffel，J Chakel et al. 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