饲料中粗蛋白检测.ppt

反刍动物饲料中蛋白的检测,-袁基策,动物饲料中包含什么？,干物质,水分,矿物质,有机物,粗蛋白,维生素,氨化物,真蛋白,无氮物,碳水化合物,粗脂肪,粗纤维,无氮浸出物,饲料,什么是蛋白质？,蛋白质是一种复杂的有机化合物。氨基酸是组成蛋白质的基本单位，氨基酸通过脱水缩合连成肽链。蛋白质是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，每一条多肽链有二十至数百个氨基酸残基（-R）不等；各种氨基酸残基按一定的顺序排列。,蛋白质的三维结构图,蛋白质的组成,蛋白质是由C（碳）、H（氢）、O（氧）、N（氮）组成，一般蛋白质可能还会含有P（磷）、S（硫）、Fe（铁）、Zn（锌）、Cu（铜）、B（硼）、Mn(锰)、I（碘）、Mo（钼）等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳50%氢7%氧23%氮16%硫03%其他微量一切蛋白质都含N元素，且各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%；蛋白质系数：任何生物样品中每1g元N的存在，就表示大约有100/16=6.25g蛋白质的存在，6.25常称为蛋白质常数。,反刍动物饲料中的粗蛋白,反刍动物饲料中的粗蛋白包括两个部分：真蛋白：即上述提到的由肽链构成的蛋白质。也称为纯蛋白。主要由饲料原料中的饼粕类提供。非蛋白氮：(NonproteinNitrogenNPN)非蛋白氮是指除真蛋白(多肽)以外的其他所有含氮物质化合物，主要是一些有机非蛋白氮化合物如氨、酰胺、胺、氨基酸和无机氮化合物如铵盐类。作为非蛋白氮补充饲料的一般为氨的衍生物：尿素、双缩脲、氨、铵盐及其它合成的简单含氮化合物。作为简单的纯化合物质，NPN对动物不能提供能量，其作用只是供给瘤胃微生物合成蛋白质所需的氮源，以节省饲料蛋白质。,蛋白质的检测方法有哪些？,凯氏定氮法质谱分析法（MS）双缩脲法（Biuret法）福林酚试剂法（Lowry法，Folin-酚法）考马斯亮蓝法（Bradford法）电泳法,凯氏定氮法Kjeldahldetermination,凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法也是国家对饲料检测的标准方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。然后乘上蛋白质常数，就得出了样品中蛋白质含量。凯氏定氮法测定的是含氮量，即饲料中包括NPN的总蛋白（粗蛋白含量）。特点是结果准确，重复性好。缺点是操作复杂，耗时耗试剂。,质谱分析法,原理：通过电源将蛋白质分子转化为气相离子（电离），然后利用质朴分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z值）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集离子，确定其M/Z值，分析鉴定蛋白质含量。优点是很高的灵敏度，能提供亚微克级的检测结果，适用于复杂配方中微量蛋白质的鉴定和结构测定。如使用高效液相色谱-串联质谱法可准确分辨出真蛋白与非蛋白氮的种类和含量。能准确测定出每一种蛋白质的含量，但需要复杂的技术水平和精密的仪器设备。且检测成本极高。,双缩脲法（Biuret法）,双缩脲法为传统的分光光度法测定蛋白质的方法，当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时，形成紫色的络合物，这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度，且在一定条件下颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，因此可以根据分光光度法来测量蛋白质的含量。可以检测出真蛋白的含量。双缩脲法检测特异性和准确度好，呈色稳定性好，试剂单一，方法简便，但灵敏度不高，约为lmg。可能会被饲料中添加的氨基酸影响。,福林酚试剂法（Lowry法）,Folin一酚法的原理与双缩脲法大体相同，利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。同时也由于Folin一酚试剂中的磷钼酸一磷钨酸试剂被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。由此可测定蛋白质的含量。由于NPN中不含肽键，所以测定是真蛋白的含量。Folin一酚法是蛋白质测定法中最灵敏的方法之一，对水溶性蛋白质含量的测定很有效。但饲料中过量添加的氨基酸会对检测结果造成一定的影响。,考马斯亮蓝法（Bradford法）,考马斯亮蓝G250是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色。蛋白质在11000微克范围内，蛋白质-色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋自质的定量测定。是目前灵敏度最高的检测方法。可准确测定真蛋白的含量。该法方法简便，易于操作，所用试剂较少，显色剂易于配制，干扰物质少。缺点是蛋白质含量较高（超过150g/ML）时结果偏差较大。,电泳法,电泳是指在电场作用下，带电粒子向着与其所带电荷电性相反的电极移动的现象。电泳法就是指带电荷的蛋白质在惰性支持介质(如滤纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，由于各组分之间的移动速度不同，使各组分分离成狭窄的区带，并用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。近年来蛋白质凝胶电泳技术在国际上迅猛发展，已成为高分辨(等电聚焦，0001pH)，高灵敏度(银染色，荧光染色，ng级)和获得大量信息(双向电泳，近万个点)的现代技术。,电泳法,目前，运用于蛋白质检测的电泳法有双向凝胶电泳法、毛细管电泳法、火箭免疫电泳法等常用与饲料分析的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。此方法有操作简便、快速、样品用量少、高自动化等优点。但是也存在核酸、多糖、脂类等干扰分子，影响检测结果。尿素是一种不带电荷的水溶性化合物。而蛋白质是带有负电荷的有机物质。故此方法只能检测出真蛋白的含量。此方法要求技术水平较高，设备和耗材的价格昂贵，且需要建立标准曲线。目前实际意义不大。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同种类的蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。饲料中的蛋白质含有许多种类，会在凝胶上出现多条区带，需要分别计算每条区带所表达的蛋白质含量，然后统计分析出蛋白含量，其过程复杂且技术含量极高。爱德使用的方法只是初步的判断蛋白质种类和含量的多少，并不能计算出准确的含量。,电泳法结果判定,爱德的实验结果豆代表豆粕棉代表棉粕1131621612318124犊牛颗粒,电泳法结果判定,总结,客户对我们产品的检测结果存在质疑时应解释清楚试验方法的不同对结果的影响非常大，因为我们的产品是合法且科学地添加了NPN，不会对奶牛和牛奶品质产生不良影响。建议客户使用凯氏定氮法进行检测。取样过程对检测结果的影响非常大，从黄梅爱德的电泳结果来看，只有2种可能：一是取样时取的粉料的上层。因运输或搬运过程中的震荡，比重较轻的麸皮等物质漂浮在袋口上层，比重较大的饼粕类饲料位于中下层。另一种可能就是取得的样品被别有用心的人掺入了其他物质或被掉包。,总结,我们以后在取样时应尽量混合均匀后取样或者抽取中下层样品，以