荧光素酶报告系统

也称为发光酶。是催化生物发光的酶的总称。它是矿物的冷水提取物在氧气中发光时，基质蠕虫荧光剂消耗后残留的热不稳定聚合物成分。目前，对萤火虫上萤火虫及发光细菌的昆虫荧光酶晶体的研究最多。它们属于氧酶，不包括金属和辅酶。发光的情况下，有需要使用ATP等作为辅助因子的酶，也有不需要的酶。发光机制等已经知道不同种类会有很大的差异，昆虫荧光素酶很特别，一般只对来自烟草接种的昆虫荧光素起作用。当然，萤火虫或萤火虫的酶并不是相互替代而发光的。萤火虫的蠕虫露西酶在干燥状态下可以相当稳定地保存下来双荧光素酶报告基因检测：高级联合报告基因测试技术，结合萤火虫和海洋肠道荧光素酶用萤光素定量基因表达时，第二个报告基因通常用于减少实验的变化因素。但是像CAT、-Gal、GUS等现有的共同报告基因，由于各自的测试化学、处理要求、检测特性存在差异，所以不方便。Promega提供了将萤火虫荧光素酶测试与海洋肠道荧光素酶测试相结合的先进双报告基因技术。双荧光素酶报告基因测试系统与PRL载体系统相结合，第二个报告基因海洋荧光素酶表达，在单管中双荧光素酶报告基因测试，快速、灵敏、简便。此外，系统还提供了PLB分解液，无需操作单个样本就可以分解在孔口培养的哺乳动物细胞。对使用荧光素酶报告基因载体的研究人员来说。双荧光素酶报告基因检测系统将立即意识到该系统的便利性。希莎双报告基因在实验系统中用于相关或比例检查，一般将一个报告基因用作内部对照组，使另一个报告基因的检测均匀化。检测基因表达时，双报告基因经常用作培养细胞瞬时转染，具有实验报告基因的载体将不同的报告基因作为对照组的第二个载体进行总转染。很多情况下，通过与控制基因的启动子结合，研究控制基因的结构和生理基础。基因表达活力的相对变化与耦合调节启动子转录活性的变化有关，连接到构成启动子的第二个报告基因提供转录活性的内部控制功能，防止测试被实验条件的变化干扰。使用这种方法可以减少被内在变化因素(如培养细胞数量和活力的差异、细胞转染和裂解的效率)削弱的实验准确度。结合萤火虫荧光素酶(CAT)、-半乳糖苷酶(-Gal)或乙醛酸糖苷酶(GUS)的报告基因近年来得到广泛应用。但是这种双报告基因组合在几秒内削弱了荧光素酶测试和量化等荧光素酶操作的优点，但是CAT，-Gal，GUS检测法在量化前需要长时间保温。还要注意，这种报告基因受灵敏度和线性反应范围的限制，不能超出这种范围，内源性细胞活力也会妨碍这种报告基因的使用。许多种类的细胞都有内源性-Gal或GUS表达，对基因表达的准确定量报告不好，细胞内脱乙酰酶活性妨碍CAT活性测试。在高温下预处理细胞分解液(1，2)会减少内源性-Gal和CAT试验的干扰，但这些处理也能加快荧光素酶的激活。因此，在这种双重报告基因检查中，应该分不同阶段处理空转的细胞分解液。理想的双报告基因方法需要用户以萤光素所具有的速度，在同一样本中对两个报告基因进行敏感线性的同时测量。传统的报告基因(如CAT、-Gal、GUS)测试化学，因此处理要求存在固有的局限性。相反，与萤火虫(Photinus pyralis)和海洋腔肠(Renilla reniformis)双荧光素酶配合，Promega的双荧光素酶报告基因测试(DLR)系统满足这些要求，并在单个管中完成此测试。双荧光素酶报告基因测试化学。荧光虫和海洋荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越测试特性，但进化上起源不同，因此酶结构和基质要求不同。这些差异用于开发DLR测试化学，有选择地区分两个发光报告基因的活力。萤火虫荧光素是61kDa单亚系蛋白，酶活性不需要翻译后修饰(3，4)，翻译后可用作遗传报告基因。ATP、Mg 2和O 2存在下甲虫卢西恩的氧化反应发光(图1)。在一般反应条件下，当路西法氧化时，如果使用路西法-AMP作为中间体，则转换非常缓慢。结果，在基质和酶混合后，测试化学产生“闪光”光，迅速衰减。专利测试试剂、定量萤光素酶活性、与辅酶A(CoA)混合、提高反应速度的快速酶转化增强(5)、持续“闪烁”发光信号(图2)。图1萤火虫和瑞尼拉荧光素酶催化的生物发光36 kDa单亚系蛋白质海洋路西法(6)包含从天然来源提炼的Renilla reniformis (6)和3%的碳水化合物，但与萤火虫荧光素一样，酶活性在翻译后无需变形，就可以用作遗传报告基因。O 2和海洋相似肠荧光素(coelenterazine)的海洋肠荧光酶催化发光反应(图1)。实验DLR测试化学时，海洋肠道路西法酶反应的动力学产生闪烁发光信号，并在检测过程中缓慢衰减(图2)。在DLR测试系统中，萤火虫和海洋肠道的路西法酶活性是用单独的分解物分阶段测定的。萤火虫荧光素酶活性(“实验”报告基因)的测定完成后，萤火虫发光迅速消失，同时海洋肠道荧光素酶的发光反应(“对照组”报告基因)被激活。因此，DLR测试系统整合了两种测试化学，快速量化共同表达的两个报告基因，酶来自转染细胞分解液或无细胞转录/翻译反应。萤火虫荧光素酶测试的线性范围扩展到酶浓度的8个阶段，可以测定1fg(约10 -20摩尔)的实验报告基因酶(图3A)。利用双荧光酶的基因检测系统、海洋肠道荧光素酶的线性范围达到酶浓度的7个水平，低底端为图2以双荧光素酶报告了基因检测萤火虫和瑞尼拉荧光素酶产生的发光。CHO细胞(110 6 /60mm培养板)转染pGL3控制和pRL SV40托架DNA。细胞用PBS清洗后，添加400l PLB制作降解物。将20l小细胞分解液和100l荧光素酶试验试剂II(LARII)混合后，立即用荧光光度计检测萤火虫荧光素酶活性(细线追踪)。100l Stop Glo TM试剂添加到荧光光度计管中，消灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活瑞氏菌荧光素酶反应，立即检测瑞氏菌荧光素酶活性(粗线追踪)。Turner Designs型号20/20荧光测绘仪配备了荧光发射跟踪计算机，并在12秒内完成了两次测试。双荧光素酶报告基因检测系统的方法量化报告基因荧光素的两个发光信号，使样品分离成组，或在制造分解液而不进行进一步处理的情况下立即执行。海洋腔场和萤火虫荧光素酶都表现出闪烁反应动力学论，因此双荧光素酶报告基因测试需要不需要试剂注射器的荧光照度测量仪。通常，DLR测试需要大约30秒才能完成，如图4中所述。在开始萤火虫荧光素酶报告基因测试时，混合1个降解物和荧光素酶测试试剂II (LAR II)。完成萤火虫荧光素酶测试后，萤火虫消灭了发光，同时激活了海洋肠道荧光素剂的发光，并将Stop Glo TM试剂添加到样品管中。在一秒内，Stop Glo TM试剂消灭比10 5度萤火虫反应大的发光信号(图5)，同时激活海洋肠道荧光酶。图3萤火虫荧光素酶和瑞尼拉荧光素酶发光反应的线性范围。精制萤火虫和瑞尼拉荧光素酶连续稀释到1PLB，包括1mg/ml BSA，带有计算机的Turner Designs fluorescent照度计用于检测初始2秒预读延迟后10秒的总荧光。在直接检测高浓度两种荧光素酶的发光反应时，在荧光照度仪的样品室中添加中性密度过滤器。要在包含10fg和100fg的Renilla fluorescein酶反应中测试发光，必须去掉海洋肠道荧光自发光的背景信号。对两种荧光素酶的发光活性分别进行了测试变化浓度绘制。图4包含人工荧光测绘仪或试剂取样器的荧光测绘仪的双荧光素酶测试方法。如果荧光光度计包含两个取样器，则事先将分解物分发给荧光光度计管，依次自动添加luciferase assay reagent ii (larii)和stop GL otm试剂。PLB裂解液专门设计的PLB分解液，无需刮伤附着细胞或进行冻融循环，就能有效地分解培养出的哺乳动物细胞。PLB设计适用于手动分解过程，但可靠的裂解效果对使用传统处理方法创建的裂解液同样有帮助。无论使用什么分解方法，在培养的哺乳动物中，PLB分解液中释放的萤火虫和海洋肠内的荧光素酶都报告基因酶是定量可靠的(图6)。被动热分解物的一个明显优点是，在水溶液中，可以抑制海洋卢格露西汀具有的固有特性低水平的非酶发光(自发光)。通常用于制造细胞分解物的试剂能提高海洋流明(包括Triton)肠道荧光自体发光吗？X-100，Promega细胞培养分解试验？还有(CCLR)和报告基因分解试剂(RLB)，这两种试剂大大抑制海洋露盖西酶的发光反应。PLB旨在最大限度地提高荧光素酶活性，将自发光降低到最小，提供最佳测试灵敏度，量化极低水平的海洋流明肠道荧光素酶。PLB还可以抑制发泡，非常适合在自动系统中用裂解液制造和测试在孔板中培养的细胞群。图5双荧光素酶报告基因检测系统消灭萤火虫荧光素酶发光，并激活瑞氏荧光素酶发光。CHO细胞分解液转染pGL3 -Control和pRL SV40载体DNA，如图2所示。萤火虫荧光素酶(报告基因1)和瑞尼拉荧光素酶(报告基因2)活性检测在10秒内完成，早期有2秒的预读延迟。Stop Glo TM试剂灭亡报告为展示基因1的高效率，添加了isometric Stop Glo TM试剂(海洋流明路西法不足，无法激活Renilla fluorescein酶反应)，萤火虫fluorescein酶发光在不激活Renilla fluorescein酶发光的情况下灭了。在这个实验中，萤火虫荧光素酶反应的残留发光度小于灭反应值的0.0004%图6用PLB分解哺乳动物细胞的高效、被动或主动分解方法。使用PGL3-Control和pRL-SV40载体DNA制造同时转染的哺乳动物细胞分解物时，将PLB放入附着细胞，将培养液轻轻摇晃15分钟(手动细胞分解)，或从培养板上刮出单板细胞，在-80 进行一次冻结/融化周期(活性细胞分解)。萤火虫和瑞尼拉荧光素酶活性通过DLR方法确定，如图4所示。为了便于比较，基因活力用活性分解方法标准化每个细胞。图a:萤火虫荧光素酶报告基因活性。图b: renil la荧光素酶报告基因活性。海洋肠道荧光素酶控制载体pRL系列设计的pRL载体系列可以在哺乳动物细胞中构成海洋卢格露西酶。这些载体包含在Renilla reniformis (7)海洋Luan类的露西酶中克隆的cDNA (R Luc)，在R Luc基因中引入3个碱基替代，去除Bgl II、Bam H I和Nar I酶切部位。这种突变不会引起海洋六安类素酶表达的氨基酸序列的变化。提供的pRL矢量有多个启动子配置，可以与萤火虫荧光素酶矢量相结合，作为报告基因活性的内部控制。PRL-TKRluc上游包含单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-TK)的启动子区域。HSV-TK启动子在胚胎和成熟哺乳动物组织细胞中，水低，能和平表达(8，9)。PRL-SV40矢量pRL- SV40包含SV40的初始增强器/启动子区域，可以在各种细胞中以高强度、可配置的方式表示Rluc。矢量pRL- 40还包括SV40的复制起始区域，例如COS-1或COS-7细胞(10)，可以即时和附着复制以表达SV40抗原。PRL-CMV向量pRL-CMV包含CMV的初始增强子/启动子区域，可以在各种细胞类型中以高强度、可配置的方式表示Rluc。在转基因小鼠中，CMV增强器/启动子具有泛主特性，在检测到的28种小鼠组织中，有24种转录活性。PRL-空矢量pRL-null真核启动子和增强器序列具有单酶切部分，该部分复制Rluc上游所需的启动子序列，并为开始海洋lugerucia表达提供最大的灵活性。图9中所示的pRL-TK托架表示pRL托架共有的特性，每个pRL托架的指定启动子的紧下游是提供海洋场内luciferane的改进表达的嵌合internet。内含子由人-珠蛋白内含子1的5-供体剪切部位和免疫球蛋白基因重链可变区域的分枝和3-受体剪切部位(12)组成。捐赠者和受体剪切部位、树枝点的序列都发生了变化，以匹配最佳剪切部位的共同序列(3)。Rluc的紧密上游有T7启动子序列，是能在体外合成海洋流明肠道荧光素的转录物质。Rluc下游为SV40后期poly (A)序列，提供有效的转录终止和mRNA多腺苷酸化(14)。载体中含有原核复制启动区和-内酰胺酶基因，可以在大肠杆菌中选择质粒扩增。图8在细胞分解物中，用被动体缓冲剂制备萤火虫和瑞尼拉荧光素酶的稳定性。标准6-鸭版培养的CHO细胞(2.5 10 5细