非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范

ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB37/T XXXXXXXXX非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范Technical specification for isothermal amplification detection of African swine feverXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所、山东师范大学、中国动物卫生与流行病学中心、山东鼎科检测技术有限公司、潍坊安普未来生物科技有限公司、上海基灵生物科技有限公司、潍坊汉森生物饲料科技有限公司。本标准主要起草人：孙文博、吴家强、陈蕾、殷斌、陈智、吴晓东、蒋文明、刘国宪、郑乾坤、李敏、杜以军、于江、时建立、吴香菊、李俊、丛晓燕、郭立辉。7非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范1 范围本标准规定了非洲猪瘟病毒（ASFV），英文缩略表见附录D，核酸的重组酶聚合酶扩增（RPA）检测技术的要求。本标准适用于非洲猪瘟的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3 原理核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链DNA，依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下开始扩增。4 试剂或材料除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。4.1 水：GB/T 6682，一级水。4.2 1PBS溶液(pH值7.4)：配制见附录A.1。4.3 核酸提取试剂：a) 蛋白酶K溶液（20 mg/mL）：配制见附录A.2；b) 10 %十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）：配制见附录A.3；c) Tris平衡酚；d) 三氯甲烷；e) 70 %乙醇：配制见附录A.4。4.4 重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒。4.5 DEPC水。4.6 恒温扩增检测的引物：恒温扩增检测引物见附录B.1。4.7 无水乙醇。4.8 微量移液器配套的带滤芯吸头。4.9 离心管：1.5 mL。5 主要仪器设备5.1 微量移液器：最大量程分别为10 L、20 L、100 L、1 000 L。5.2 生物安全柜。5.3 普通冰箱。5.4 涡旋振荡器。5.5 研磨管。5.6 荧光定量PCR仪：Peltier加热，16孔（0.2 mL，28联管和单管）。5.7 电子天平：感量为0.001 g。5.8 低温高速台式离心机：离心力8 000 g。6 样品6.1 基本要求应符合GB 194892008和NY/T 5412016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输的要求。6.2 样品采集6.2.1 棉拭子样品无菌操作，采集猪口腔拭子。6.2.2 组织样品无菌操作，取猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2 8 低温运至实验室。6.2.3 环境样品相关场所的粪便、饲料、污水样品。2 8 低温运至实验室。6.3 样品处理6.3.1 口腔拭子样品处理口腔拭子管6 000 r/min震荡45 s，取200 L进行核酸提取。6.3.2 脾、肺、肾等组织样品处理取0.05 g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 r/min震荡研磨45 s，制成约10 %的组织匀浆液，5 000 g离心5 min，取200 L上清液进行核酸提取。6.3.3 粪便、饲料样品处理取1 g粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 r/min震荡研磨45 s，制成约10 %的匀浆液，5 000 g离心5 min，取200 L上清液进行核酸提取。6.3.4 污水样品处理取200 L污水进行核酸提取。7 操作步骤7.1 取6.2处理后的样品500 L加入10 %SDS溶液50 L、20 mg/mL蛋白酶K溶液10 L，于55 水浴2 h3 h。7.2 加入200 L Tris平衡酚，混匀，4 12 000 g离心15 min。7.3 取上清液500 L，加入200 L Tris平衡酚和200 L三氯甲烷，4 12 000 g离心15 min。 7.4 取上清液400 L，加入200 L三氯甲烷，4 12 000 g离心15 min。7.5 取上清液300 L，加入2倍体积的无水乙醇，-20 静置20 min，4 12 000 g离心15 min。7.6 弃上清液，加入1 mL 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。7.7 加入20 L灭菌一级水溶解沉淀，-20 保存备用。7.8 也可选择市售商品化DNA提取试剂盒，完成DNA的提取。7.9 设50 L反应体系，详见附录B.2。7.10 每次反应设置试验中同时质粒DNA作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。具体反应程序见附录B.3。8 结果判定8.1 结果判读见表1。表1 结果判定序号通道Ct值结果判断1FAM未检测到或40样本核酸浓度低于检测限，报告为阴性2FAM37报告为阳性3FAM37-40复检一次，如仍为37-40，则报告为阴性8.2 阴性对照和阳性对照，有任一结果异常，需要重新检测。8.3 结果参考图谱：见附录C.1。AA附录A （规范性附录）试剂的配制A.1 1PBS溶液(pH值7.4)磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27 g。磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42 g。氯化钠(NaCl)：8 g。氯化钾(KCl)：0.2 g。加灭菌水约800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH值至7.4，最后定容到1 L。A.2 蛋白酶K溶液(20 mg/mL) 蛋白酶K 100 mg灭菌一级水 5 mLA.3 10 %十二烷基硫酸钠(SDS溶液，pH7.2)十二烷基硫酸钠 10 g灭菌一级水 80 mL浓盐酸 调pH至7.2灭菌一级水 加至100 mLA.4 70 %乙醇无水乙醇 70 mL灭菌一级水 30 mLBB附录B （规范性附录）恒温核酸扩增引物、反应液体系与反应条件B.1 恒温核酸扩增引物见表B.1。表B.1 恒温核酸扩增引物引物序列Asfv-F5- CTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAC-3Asfv-R5- GAGATACAGCTCTTCCAGAYGCATGTTCATC -3Asfv-Probe5-AGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAACTTAFCTABAAGATTGATACCATG-3注： F为FAM荧光基团标记、T为THF、B为BHQ1淬灭基团标记、3末端为C3 Spacer标记。B.2 恒温核酸扩增反应液体系见表B.2。表B.2 恒温核酸扩增反应液体系组分用量LDEPC水8.5A Buffer29.410 M 上游引物210 M下游引物210 M 探针0.6模板DNA5B Buffer2.5B.3 恒温核酸扩增反应条件见表B.3。表B.3 恒温核酸扩增反应条件反应条件反应温度39 C循环数40信号采集每30S反应时间20 minCC附录C （规范性附录）样品检测结果图样品检测结果见图C.1。图C.1 样品检测结果图DD附录D （规范性附录）英文缩略表英文缩略表见表D.1。表D.1 英文缩略表英文缩写英文全称中文名ASFVAfrican swine