饲草中主要农药残留及真菌毒素的测定　第2部分：饲草中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的测定　液相色谱-串联质谱法

ICS65.120B 25DB37山东省地方标准DB37/T XXXXXXXXX饲草中主要农药残留及真菌毒素的测定第2部分：饲草中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的测定液相色谱-串联质谱法Determination of main pesticide residues and mycotoxin in fodder grassPart2：Determination of deoxynivalenol and zearalenone in fodder grassby high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometryXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/T XXXXXXXXX前言DB37/T 饲草中主要农药残留及真菌毒素的测定分为三个部分：第1部分：饲草中10种杀虫剂农药残留量的测定气相色谱-串联质谱法；第2部分：饲草中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的测定液相色谱-串联质谱法；第3部分：饲草中伏马毒素的测定方法液相色谱-串联质谱法。本部分为DB37/T 的第2部分。本部分按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本部分由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本部分由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本部分起草单位：山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所。本部分主要起草人：邓立刚、李霞、李增梅、王峰恩、官帅、陈璐、杨琳琳、李香。5饲草中主要农药残留及真菌毒素的测定第2部分：饲草中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的测定液相色谱-串联质谱法警示：整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光(阳光)，具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。在整个实验过程中，操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。1 范围本标准规定了饲草中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于饲草中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的测定。本方法检出限：脱氧雪腐镰刀菌烯醇为10 g/kg和玉米赤霉烯酮为5 g/kg；定量限：脱氧雪腐镰刀菌烯醇为25 g/kg和玉米赤霉烯酮为10 g/kg。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3 原理试样经乙腈-甲酸水溶液提取，经QuEChERS萃取包净化后，氮气吹干，甲醇-水溶液复溶，液相色谱分离，串联质谱检测，内标法定量。4 试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水符合GB/T 6682一级水的规定。4.1 甲醇：色谱纯。4.2 甲酸：色谱纯。4.3 乙腈：色谱纯。4.4 提取液：准确量取乙腈（4.3）800 mL，加入甲酸（4.2）10 mL，用水定容至1 000 mL。4.5 甲醇溶液：量取甲醇（4.1）100 mL，加入水100 mL，混匀，备用。4.6 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON，C15H20O6，CAS：51481 - 10 - 8）标准溶液：100 g/mL。4.7 玉米赤霉烯酮（ZEN，C18H22O5，CAS：17924 - 92 - 408）标准溶液：100 g/mL。4.8 脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素内标（13C15-DON，13C15H20O6）溶液：25 g/mL。4.9 混合标准中间液溶液：准确吸取1.0 mL脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液（4.6）和0.1 mL玉米赤霉烯酮标准溶液（4.7）于10 mL容量瓶中，用水定容，此时脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度为10 g/mL，玉米赤霉烯酮浓度为1 g/mL，于-20 冰箱保存。4.10 同位素内标溶液：准确吸取1.0 mL脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素标准溶液（4.8）于10 mL容量瓶中，用水定容，此时浓度为2.5 g/mL，于-20 冰箱保存。4.11 QuEChERS盐包：4.0 g硫酸镁，1.0 g氯化钠，1.0 g柠檬酸钠，0.5 g柠檬酸二钠盐倍半水合物。4.12 微孔滤膜：有机相，0.22 m。5 仪器设备5.1 液相色谱三重四级杆质谱联用仪：配电喷雾离子源（ESI源）。5.2 分析天平：感量0.01 g。5.3 离心机：转速不低于8 000 r/min。5.4 氮吹仪，可控温。5.5 粉碎机。5.6 涡旋混合器。5.7 恒温振荡器。6 试样的制备样品粉碎后充分混匀，于18 下保存。7 测定步骤7.1 前处理准确称取平行试样，干样2 g或鲜样5 g于50 mL离心管中，加入20 mL提取液（4.4），涡旋混匀后于恒温振荡器中振荡30 min；加入QuEChERS盐包（4.11），涡旋2 min，充分混匀，8 000 r/min离心5 min，取2 mL上清液，加20 L同位素内标溶液（4.10），置于40 水浴中氮吹至近干；用甲醇溶液（4.5）复溶，定容至0.5 mL，旋涡振荡1 min，过微孔滤膜（4.12），用于测定。7.2 测定7.2.1 液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a) 色谱柱：C18色谱柱，柱长100 mm，柱内径2.1 mm，颗粒内径1.7m，或性能相当者；b) 流动相：0.1 %甲酸溶液（流动相A），乙腈（流动相B）；c) 流速：0.3 mL/min；d) 进样量：2.0 L；e) 柱温：40 ；f) 流动相及梯度洗脱条件见表1。表1 流动相梯度洗脱条件时间min流动相A流动相B090100.290102.010904.010904.590107.090107.2.2 质谱参考条件质谱参考条件如下：a) 离子源：电喷雾离子源( ESI+）；b) 毛细管电压：3.5 KV；c) 离子源温度：120 ；d) 脱溶剂气温度：500 ；e) 扫描模式：正离子；f) 监测方式：多反应监测（MRM），监测条件见表2。表2 多反应监测（MRM）条件化合物名称母离子m/z锥孔电压V定量离子m/z碰撞能量eV定性离子m/z碰撞能量eVDON297.130249.110203.116ZEN319.120283.119187.11113C15-DON312.030263.0167.2.3 标准曲线的绘制准确吸取适量混合标准溶液和同位素内标溶液，用甲醇水溶液(4.5)配制成10g/L、20g/L、50g/L、100g/L、200g/L和500g/L混合标准溶液系列，其中同位素内标溶液浓度为100g/L，上机测定，绘制标准曲线。7.3 定性及定量7.3.1 定性测定通过试样色谱图的特征离子与相应对照溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时间的相对误差不大于2.5 %；试样特征离子的相对离子丰度与标准品特征离子的相对离子丰度一致，相对离子丰度偏差不超过表3的规定，则可判断试样中含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差相对离子丰度50 %20 %50 %（含）10 %20 %（含）10 %允许的相对偏差202530507.3.2 定量外标法定量。7.4 试样溶液的测定将基质标准工作溶液和试样溶液依次注入液相色谱质谱联用仪中，保留时间和定性离子定性，测定定量离子峰面积，待测样液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的响应值应在仪器检测的定量测定线性范围之内，超过线性范围时应根据测定浓度进行适当倍数稀释后再进行分析。7.5 空白试验除不加试料外，按照7.17.4规定进行平行操作。8 分析结果的表述试料中被测脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮残留量以质量分数计，单位以微克每千克（g/kg）表示，按公式（1）计算：(1)式中：试料中被测物残留量，单位为微克每千克（g/kg）；从基质混合标准曲线上得到的样液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的质量浓度，单 位为微克每升（g/L）；V1 样品提取液体积，单位为毫升（mL）；V2 待浓缩的上清液体积，单位为毫升（mL）；V3 试样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m 试料的质量，单位为克（g）。计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数